In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte
Summary
Kombinatorische 5 fluoreszierenden Proteinen markiert von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen in vivo ermöglicht klonalen Tracking über die konfokale und Zwei-Photonen-Mikroskopie, die einen Einblick in die Knochenmark blutbild Architektur während der Regeneration. Dieses Verfahren ermöglicht nicht-invasive Abbildung von Schicksal spektral kodierten HSPCs abgeleiteten Zellen in intaktem Gewebe für ausgedehnte Zeiträume nach der Transplantation.
Abstract
Wir entwickelt und validiert eine Fluoreszenzmarkierung Methode zur Verfolgung von klonalen hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen (HSPCs) mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung in vivo Blutbildung zu studieren mit der Maus-Knochenmark-Transplantation experimentellen Modell. Genetische kombinatorische Markierung mit lentiviralen Vektoren fluoreszierende Proteine (RP) kodiert, aktiviert das Zellschicksal Mapping durch moderne Mikroskopie. Vektoren fünf verschiedenen Rahmenprogrammen codiert Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato und mCherry wurden verwendet, um gleichzeitig zu transduzieren HSPCs, Schaffung einer vielfältigen Farbpalette markierten Zellen. Imaging mittels konfokaler / Zwei-Photonen-Mikroskopie Hybrid ermöglicht die gleichzeitige hochauflösende Beurteilung der eindeutig gekennzeichneten Zellen und deren Nachkommen in Verbindung mit strukturellen Komponenten der Gewebe. Volumenanalysen über große Flächen zeigen, dass spektral kodierten HSPC-abgeleiteten Zellen nicht-invasiv in verschiedenen intakten Geweben, einschließlich Knochenmark nachgewiesen werden (BM) Für ausgedehnte Zeiträume nach der Transplantation. Live-Studien die Kombination von Video-Multirate und konfokaler Zeitraffer-Bildgebung in 4D zeigen die Möglichkeit der dynamischen zellulären und klonalen Tracking in quantitativer Weise.
Introduction
Die Produktion von Blutzellen, genannt Hämatopoese durch eine kleine Population von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen (HSPCs) gehalten. Diese Zellen befinden sich im Knochenmark (BM) in einer komplexen Mikroumgebungs Nische, bestehend aus Osteoblasten, Stromazellen, Fettgewebe und Gefäßstrukturen, die alle in der Steuerung der Selbsterneuerung und Differenzierung 1,2 gebracht. Als intakte BM traditionell unzugänglich direkte Beobachtungen wurde, bleibt die Wechselwirkungen zwischen HSPC und ihre Mikroumgebung in vivo weitgehend charakterisiertes. Bisher haben wir eine Methodik, um die 3D-Architektur von intakten BM mit Hilfe der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie und Reflexion 3 zu visualisieren. Wir gekennzeichnet Ausbau der EGFP-markierte HSPCs in der BM, aber die Verwendung von nur einer einzigen FP ausgeschlossen Analyse der Regeneration bei einer klonalen Ebene. Erst vor kurzem haben wir den Vorteil des lentiviralen Gene Ontology (Lego)-Vektoren, die konstitutiv fluorescent Proteine (RP), um effizient zu markieren Zellen 4,5. Co-Transduktion HSPC mit 3 oder 5-Vektoren erzeugt eine vielfältige Palette von kombinatorischen Farben, so dass Tracking von mehreren Einzel HSPC Klonen.
Markiert HSPC mit neuen Imaging-Technologie erlaubt, einzelne HSPC Homing und Transplantation in der BM von bestrahlten Mäusen Spuren kombiniert. Lego-Vektoren wurden verwendet, um HSPC mit 3 oder 5 verschiedene Rahmenprogramme (von Cerulean, eGFP, Venus, tdTomato und mCherry) markieren und folgen ihrer Transplantation im Laufe der Zeit in der BM durch konfokale und 2-Photonen-Mikroskopie, so dass klare Visualisierung von Knochen und anderem Matrixstrukturen und das Verhältnis von HSPC Klone Komponenten ihrer Mikroumgebung. HSPC wurden als die Linie negative Zellen aus C57BL / 6 Mäusen BM, der mit Lego-Vektoren transduziert gereinigt und durch Schwanzveneninjektion in Myelo-abgetragen kongenen Mäuse reinfundiert. Durch die Überwachung der große Mengen des Brustbeins BM Gewebe visualisiert wir endostalen Transplantation früh auftretendenBM Regeneration. Zellcluster mit verschiedenen Farbspektren erschien zunächst in der Nähe der Knochen und voran zentral über die Zeit. Interessant ist, dass nach mehr als 3 Wochen das Knochenmark bestand aus makroskopischen klonalen Clustern, was darauf hindeutet Ausbreitung der Blutbildung aus einzelnen HSPCs abgeleitet zusammenhängend im Knochenmark, sondern als umfassende Verbreitung HSPCs über die Blutbahn. Es war weniger Farbvielfalt am späten Zeitpunkten, was auf Schwierigkeiten bei der Wandlerlangfristige Bestandsauffüllung Zellen mit mehreren Vektoren.
Zusätzlich gebildet HSPCs Cluster in der Milz, ein Organ auch die Hämatopoese bei Mäusen verantwortlich ist. HPSC abgeleiteten einzelnen Zellen konnten in Thymus als auch gelöst werden, Lymphknoten, Milz, Leber, Lunge, Herz, Haut, Skelettmuskel, Fettgewebe und Niere. Die 3D-Bilder können qualitativ und quantitativ bewertet werden, um die Verteilung der Zellen mit minimalen Störungen der Gewebe zu schätzen. Schließlich zeigen wird die Machbarkeit der Live-dynamische Untersuchungen in 4D durch die Kombination von Resonanz Scannen Multi und konfokaler Zeitraffer-Bildgebung. Diese Methodik ermöglicht nicht-invasive hohe Auflösung, mehrdimensionale Zell-Schicksal Rückverfolgung von spektral markierten Zellen Populationen in ihrer intakten 3D-Architektur und bietet ein leistungsfähiges Werkzeug in der Erforschung der Geweberegeneration und Pathologie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir beschreiben hier die Details eines leistungsfähigen Methodik vor kurzem für klonalen Zellverfolgung entwickelt und kombiniert die große Vielfalt, die durch kombinatorische Markierung mit 5FP-kodierenden LEGO Vektoren und Bildgebung mit Tandem-konfokale und 2-Photonen-Mikroskopie, um volumetrische und dynamische Bildgebung in lebenden Geweben zu erreichen erzeugt. Dies erweitert den Einsatz von FP-basierte Farbmarkierung durch Aufnahme konfokalen Spektral-Identität in 5 "deutliche" 8-Bit-Kanäle. Damit …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Intramural Research Program of the National Heart, Lung, Blood Institute of the National Institutes of Health. We thank Boris Fehse (University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Germany) for providing the five LeGO vector plasmids; Christian A. Combs and Neal S. Young (NHLBI, NIH) for discussions, support and encouragement throughout this study, and Andre LaRochelle (NHLBI, NIH) for assistance with tail vein injections.
Materials
| Production of viruses | |||
| LeGO-Cer2 | Addgene | 27338 | Expression of Cerulean |
| LeGO-G2 | Addgene | 25917 | Expression of eGFP |
| LeGO-V2 | Addgene | 27340 | Expression of Venus |
| LeGO-T2 | Addgene | 27342 | Expression of tdTomato |
| LeGO-C2 | Addgene | 27339 | Expression of mCherry |
| Calciumm Phosphate Transfection Kit | Sigma | CAPHOS-1KT | |
| Tissue culture dish | BD Falcon | 353003 | |
| IMDM | Gibco, Life Technology | 12440-053 | |
| Fetal Bovine Serum Heat Inactivated | Sigma | F4135-500ML | |
| Pen Strep Glutamine | Gibco, Life Technology | 10378-016 | |
| Centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW28 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L60 | |
| Millex Syringe Driven Filter Unite (0.22um) | Millipore | SLGS033SS | |
| Mouse cell collection, purification, transduction and transplantation | |||
| ACK lysing buffer | Quality Biologicals Inc. | 118-156-101 | |
| Lineage Cell Depletion Kit (mouse) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-090-858 | |
| LS columns + tubes | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-306 | |
| Pre-Separation Filters (30um) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-407 | |
| StemSpan SFEM serum-free medium for culture and expansion of hematopoietic cells (500mL) | StemCell Technologies Inc | 9650 | |
| murine IL-11 CF | R & D Systems Inc | 418-ML-025/CF | |
| recombinant murine SCF | RDI Division of Fitzgerald Industries Intl | RDI-2503 | |
| recombinant murine IL-3 | R & D Systems Inc | 403-ML-050 | |
| FLT-3 Ligand | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-096-480 | |
| 12-well plates, Costar | Corning Inc. | 3527 | |
| Retronectin | Takara Bio Inc | T100A/B | |
| Protamine Sulfate | Sigma | P-4020 | |
| Confocal and two-photon microscopy | |||
| DMEM | Lonza | 12-614F | |
| 1M Hepes | Cellgro, Mediatech Inc. | 25-060-CI | |
| Glass bottom culture dish P35G-0-20-C | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | |
| Glass bottom culture dish P35G-0-14-C | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass #1 Borosilicate coverglass; 4-well | Thermo Scientific | 155383 | |
| Leica TCS SP5 AOBS five channels confocal and multi-photon microscope | Leica Microsystems | ||
| Chameleon Vision II -TiSaph laser range 680-1080nm | Coherent | ||
| Chameleon Compact OPO laser range 1030-1350nm | Coherent | ||
| HCX-IRAPO-L 25x/0.95 NA water dipping objective (WD=2.5 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PLAPO-CS 20x/0.70 NA dry objective (WD=0.6 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PL-IRAPO 40x/1.1NA water immersion objective (WD=0.6 mm) | Leica Microsystems | ||
| Imaris software version 7.6 | Bitplane |
References
- Lo Celso, ., C, D. T., Scadden, The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124, 3529-3535 (2011).
- Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
- Takaku, T., et al. Hematopoiesis in 3 dimensions human and murine bone marrow architecture visualized by confocal microscopy. Blood. 116, e41-e55 (2010).
- Malide, D., Metais, J. Y., Dunbar, C. E. Dynamic clonal analysis of murine hematopoietic stem and progenitor cells marked by 5 fluorescent proteins using confocal and multiphoton microscopy. Blood. 120, e105-e116 (2012).
- Weber, K., Mock, U., Petrowitz, B., Bartsch, U., Fehse, B. Lentiviral gene ontology (LeGO) vectors equipped with novel drug-selectable fluorescent proteins new building blocks for cell marking and multi-gene analysis. Gene Ther. 17, 511-520 (2010).
- Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. A multicolor panel of novel lentiviral ‘gene ontology’ (LeGO) vectors for functional gene analysis. Mol Ther. 16, 698-706 (2008).
- Weber, K., et al. RGB marking facilitates multicolor clonal cell tracking. Nat Med. 17, 504-509 (2011).
- Lo Celso, ., Lin, C. P., Scadden, D. T. In vivo imaging of transplanted hematopoietic stem and progenitor cells in mouse calvarium bone marrow. Nature protocols. 6, 1-14 (2011).
- Kohler, A., et al. Altered cellular dynamics and endosteal location of aged early hematopoietic progenitor cells revealed by time-lapse intravital imaging in long bones. Blood. 114, 290-298 (2009).
- Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys J. 82, 493-508 (2002).
- Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119, 238-250 (2012).
