In vivo Klonale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen Gekenmerkt door Five fluorescerende eiwitten met behulp van confocale microscopie en Multiphoton
Summary
Combinatorische 5 fluorescerende eiwitten markering van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen maakt in vivo klonale volgen via confocale en twee-foton microscopie, het verstrekken van inzicht in het beenmerg hematopoietische architectuur tijdens de regeneratie. Deze methode maakt het mogelijk niet-invasieve lot in kaart brengen van spectraal-gecodeerde HSPCs-afgeleide cellen in intacte weefsels voor langere perioden na de transplantatie.
Abstract
We ontwikkeld en gevalideerd een fluorescerende markering methodologie voor klonale volgen van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen (HSPCs) met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie te bestuderen in vivo hematopoiesis behulp van de muizen beenmergtransplantatie experimenteel model. Genetische combinatorische markering met behulp van lentivirale vectoren die coderen voor fluorescerende eiwitten (KP's) geactiveerd lot van de cel in kaart brengen door middel van geavanceerde microscopie beeldvorming. Vectoren die coderen voor vijf verschillende KP's: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato en mCherry werden gebruikt om gelijktijdig transduce HSPCs, het creëren van een divers palet van kleur gemarkeerd cellen. Beeldvorming met behulp van confocale / twee-foton hybride microscopie maakt gelijktijdig hoge resolutie beoordeling van unieke gemarkeerde cellen en hun nakomelingen in combinatie met structurele componenten van de weefsels. Volumetrische analyse over grote gebieden bekend dat spectraal gecodeerde HSPC-afgeleide cellen niet-invasieve wijze verschillende intacte weefsels, waaronder het beenmerg kan worden gedetecteerd (BM), Voor langere perioden na de transplantatie. Levende onderzoeken gecombineerd video-rate multiphoton enconfocale time-lapse imaging in 4D tonen de mogelijkheid van dynamische cellulaire en klonale volgen op een kwantitatieve wijze.
Introduction
De productie van bloedcellen, aangeduid hematopoiese wordt onderhouden door een kleine populatie van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen (HSPCs). Deze cellen verblijven in het beenmerg (BM) in een complex micro-omgeving niche bestaande uit osteoblasten, stromacellen, vetweefsel en vasculaire structuren, alle betrokken bij de controle van zelfvernieuwing en differentiatie 1,2. Al intact BM traditioneel ontoegankelijk voor directe waarneming is geweest, de interacties tussen HSPC en hun micro-omgeving grotendeels uncharacterized in vivo. Eerder hebben we een methodologie om de 3D-architectuur van intacte BM te visualiseren met behulp van confocale fluorescentie en reflectie microscopie 3. We kenmerk uitbreiding van EGFP gemarkeerde HSPCs in de BM, maar het gebruik van slechts een enkele FP uitgesloten analyse van regeneratie op klonale niveau. Zeer recent hebben we geprofiteerd van de Lentiviral Gene Ontology (lego) vectoren die constitutief flfluorescerende eiwitten (KP) om efficiënt cellen 4,5 markeren. Co-transductie van HSPC met 3 of 5 vectoren genereert een divers palet van combinatorische kleuren, waardoor het bijhouden van meerdere afzonderlijke HSPC klonen.
Gemarkeerd HSPC combinatie met nieuwe imaging technologie toegestaan om individuele HSPC homing en innesteling te traceren in de BM van bestraalde muizen. LEGO vectoren werden gebruikt om HSPC markeren met 3 of 5 verschillende KP's (van Cerulean, eGFP, Venus, tdTomato en mCherry) en volg hun innesteling na verloop van tijd in de BM door confocale en 2-foton microscopie, waardoor duidelijke visualisatie van bot en andere matrix structuren, en de verhouding van HSPC klonen componenten van hun micromilieu. HSPC werden gezuiverd zoals het geslacht negatieve cellen van C57BL / 6 muizen BM, getransduceerd met vectoren LEGO en reinfused staartader injectie in myelo-geablateerd congenic muizen. Door het monitoren van grote hoeveelheden van het borstbeen BM weefsel gevisualiseerd we endosteale innesteling plaatsvindt in het begin vanBM regeneratie. Cell clusters met verschillende kleur spectra bleek aanvankelijk dicht bij het bot en vorderde gecentreerd over de tijd. Interessant, na meer dan 3 weken merg bestond macroscopische klonale clusters suggereert verspreiding van hematopoiese afgeleid van individuele HSPCs aansluitend in het merg, dan ruime verspreiding van HSPCs via de bloedbaan. Er was minder kleurendiversiteit op late tijdstippen, suggereert moeilijkheden transduceren langdurige herbevolking cellen met meerdere vectoren.
Bovendien HSPCs gevormd clusters in de milt, een orgaan verantwoordelijk voor hematopoiesis in muizen. -HPSC afgeleide individuele cellen kunnen worden opgelost in de thymus, lymfeklieren, milt, lever, long, hart, huid, spier, vetweefsel en nieren van. De 3D-beelden kan kwalitatief en kwantitatief worden beoordeeld om de verdeling van cellen met minimale verstoringen van de weefsels waarderen. Tot slot, we illustrerend de haalbaarheid van live-dynamische studies in 4D door het combineren van resonante scannen multifoton en confocale time-lapse imaging. Deze methode maakt het niet-invasief hoge resolutie, multidimensionale cel-lot traceren van spectraal duidelijk celpopulaties in intacte 3D architectuur, die een krachtig hulpmiddel in de studie van weefselregeneratie en pathologie.
Protocol
Representative Results
Discussion
We beschrijven hier de details van een krachtige methodologie onlangs bedacht voor klonale cell tracking, het combineren van de grote diversiteit gegenereerd door combinatorische markering met-5FP coderen LEGO vectoren en beeldvorming met tandem confocale en 2-foton microscopie om volumetrische en dynamische beeldvorming te realiseren in levende weefsels. Dit breidde het gebruik van FP-gebaseerde kleur markering door het opnemen van confocale spectrale identiteit in 5 "verschillende" 8-bit kanalen. Dus de rela…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Intramural Research Program of the National Heart, Lung, Blood Institute of the National Institutes of Health. We thank Boris Fehse (University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Germany) for providing the five LeGO vector plasmids; Christian A. Combs and Neal S. Young (NHLBI, NIH) for discussions, support and encouragement throughout this study, and Andre LaRochelle (NHLBI, NIH) for assistance with tail vein injections.
Materials
| Production of viruses | |||
| LeGO-Cer2 | Addgene | 27338 | Expression of Cerulean |
| LeGO-G2 | Addgene | 25917 | Expression of eGFP |
| LeGO-V2 | Addgene | 27340 | Expression of Venus |
| LeGO-T2 | Addgene | 27342 | Expression of tdTomato |
| LeGO-C2 | Addgene | 27339 | Expression of mCherry |
| Calciumm Phosphate Transfection Kit | Sigma | CAPHOS-1KT | |
| Tissue culture dish | BD Falcon | 353003 | |
| IMDM | Gibco, Life Technology | 12440-053 | |
| Fetal Bovine Serum Heat Inactivated | Sigma | F4135-500ML | |
| Pen Strep Glutamine | Gibco, Life Technology | 10378-016 | |
| Centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW28 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L60 | |
| Millex Syringe Driven Filter Unite (0.22um) | Millipore | SLGS033SS | |
| Mouse cell collection, purification, transduction and transplantation | |||
| ACK lysing buffer | Quality Biologicals Inc. | 118-156-101 | |
| Lineage Cell Depletion Kit (mouse) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-090-858 | |
| LS columns + tubes | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-306 | |
| Pre-Separation Filters (30um) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-407 | |
| StemSpan SFEM serum-free medium for culture and expansion of hematopoietic cells (500mL) | StemCell Technologies Inc | 9650 | |
| murine IL-11 CF | R & D Systems Inc | 418-ML-025/CF | |
| recombinant murine SCF | RDI Division of Fitzgerald Industries Intl | RDI-2503 | |
| recombinant murine IL-3 | R & D Systems Inc | 403-ML-050 | |
| FLT-3 Ligand | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-096-480 | |
| 12-well plates, Costar | Corning Inc. | 3527 | |
| Retronectin | Takara Bio Inc | T100A/B | |
| Protamine Sulfate | Sigma | P-4020 | |
| Confocal and two-photon microscopy | |||
| DMEM | Lonza | 12-614F | |
| 1M Hepes | Cellgro, Mediatech Inc. | 25-060-CI | |
| Glass bottom culture dish P35G-0-20-C | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | |
| Glass bottom culture dish P35G-0-14-C | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass #1 Borosilicate coverglass; 4-well | Thermo Scientific | 155383 | |
| Leica TCS SP5 AOBS five channels confocal and multi-photon microscope | Leica Microsystems | ||
| Chameleon Vision II -TiSaph laser range 680-1080nm | Coherent | ||
| Chameleon Compact OPO laser range 1030-1350nm | Coherent | ||
| HCX-IRAPO-L 25x/0.95 NA water dipping objective (WD=2.5 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PLAPO-CS 20x/0.70 NA dry objective (WD=0.6 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PL-IRAPO 40x/1.1NA water immersion objective (WD=0.6 mm) | Leica Microsystems | ||
| Imaris software version 7.6 | Bitplane |
References
- Lo Celso, ., C, D. T., Scadden, The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124, 3529-3535 (2011).
- Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
- Takaku, T., et al. Hematopoiesis in 3 dimensions human and murine bone marrow architecture visualized by confocal microscopy. Blood. 116, e41-e55 (2010).
- Malide, D., Metais, J. Y., Dunbar, C. E. Dynamic clonal analysis of murine hematopoietic stem and progenitor cells marked by 5 fluorescent proteins using confocal and multiphoton microscopy. Blood. 120, e105-e116 (2012).
- Weber, K., Mock, U., Petrowitz, B., Bartsch, U., Fehse, B. Lentiviral gene ontology (LeGO) vectors equipped with novel drug-selectable fluorescent proteins new building blocks for cell marking and multi-gene analysis. Gene Ther. 17, 511-520 (2010).
- Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. A multicolor panel of novel lentiviral ‘gene ontology’ (LeGO) vectors for functional gene analysis. Mol Ther. 16, 698-706 (2008).
- Weber, K., et al. RGB marking facilitates multicolor clonal cell tracking. Nat Med. 17, 504-509 (2011).
- Lo Celso, ., Lin, C. P., Scadden, D. T. In vivo imaging of transplanted hematopoietic stem and progenitor cells in mouse calvarium bone marrow. Nature protocols. 6, 1-14 (2011).
- Kohler, A., et al. Altered cellular dynamics and endosteal location of aged early hematopoietic progenitor cells revealed by time-lapse intravital imaging in long bones. Blood. 114, 290-298 (2009).
- Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys J. 82, 493-508 (2002).
- Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119, 238-250 (2012).
