In vivo suivi clonale de cellules souches hématopoïétiques et progénitrices Marqué par cinq protéines fluorescentes confocale et multiphotonique Microscopie
Summary
Combinatoires 5 protéines fluorescentes de marquage des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques permet in vivo suivi clonale par confocale et microscopie à deux photons, apportant des éclairages sur la moelle osseuse hématopoïétique architecture lors de la régénération. Cette méthode permet de cartographier de sort non-invasif des cellules HSPCs dérivés spectrale codés dans des tissus intacts pour de longues périodes de temps après la transplantation.
Abstract
Nous avons développé et validé une méthodologie pour le suivi clonale de cellules souches hématopoïétiques et progénitrices (HSPCs) avec une résolution spatiale et temporelle pour étudier dans l'hématopoïèse in vivo en utilisant la greffe de moelle osseuse modèle expérimental murin marquage fluorescent. Marquage utilisant des vecteurs lentiviraux codant pour des protéines fluorescentes (PC) combinatoire génétique activé cartographie du destin cellulaire grâce à l'imagerie par microscopie de pointe. Vecteurs codant pour cinq médecins de famille différents: Cerulean, EGFP, Vénus, tdTomato, et mCherry ont été utilisés pour la transduction simultanément HSPCs, la création d'une palette variée de cellules de couleur marquée. Imagerie confocale / microscopie à deux photons hybride permet simultanée évaluation à haute résolution de cellules marquées unique et leur progéniture en association avec des composants de structure des tissus. Analyse volumétrique sur de grandes surfaces révèlent que les cellules dérivées de HSPC spectralement codées peuvent être détectées de manière non invasive dans divers tissus, y compris les intactes de la moelle osseuse (BM), Pendant de longues périodes de temps après la transplantation. Études en direct combinant multiphotonique vidéo-taux et imagerie confocale time-lapse en 4D démontrent la possibilité de suivi cellulaire clonale et dynamique de manière quantitative.
Introduction
La production de cellules sanguines, appelé hématopoïèse, est maintenue par une petite population de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (hspC). Ces cellules se trouvent dans la moelle osseuse (BM) dans un créneau de microenvironnement complexe constitué des ostéoblastes, les cellules stromales, le tissu adipeux, et les structures vasculaires, tous impliqués dans le contrôle de l'auto-renouvellement et de différenciation 1,2. Comme intact BM a toujours été inaccessible à l'observation directe, les interactions entre les CSPS et leur microenvironnement reste largement non caractérisés in vivo. Auparavant, nous avons établi une méthodologie de visualiser l'architecture 3D de BM intact confocale de fluorescence et microscopie de réflexion 3. Nous avons caractérisé l'expansion de HSPCs EGFP-marquées dans la BM, mais l'utilisation d'un seul FP empêchés analyse de régénération à un niveau clonale. Très récemment, nous avons profité de la Lentiviral Gene Ontology (Lego) vecteurs exprimant de manière constitutive flprotéines fluorescents (MF) pour marquer efficacement les cellules 4,5. Co-transduction de CSPS avec 3 ou 5 vecteurs génère une palette variée de couleurs combinatoires, permettant le suivi de plusieurs clones individuels CSPS.
Marqué CSPS combiné avec la nouvelle technologie d'imagerie permis de retracer individu homing CSPS et la prise de greffe à la BM de souris irradiées. LEGO vecteurs ont été utilisés pour marquer CSPS avec 3 ou 5 MF différentes (de Cerulean, eGFP, Vénus, tdTomato, et mCherry) et suivre leur greffe dans le temps du BM par microscopie confocale et 2 photons, ce qui permet une visualisation claire de l'os et d'autres structures de matrice, et la relation de clones de HSPC composantes de leur micro-environnement. CSPS ont été purifiés que les lignées de cellules négatives de souris C57BL / 6 BM, transduites avec des vecteurs LEGO, et réinjecté par injection dans la veine de la queue des souris congéniques myélo-ablation. En surveillant de grands volumes de tissu sternum BM nous avons visualisé greffe endo-osseux survenant au début deRégénération BM. des agrégats de cellules avec des spectres de couleur variée apparus initialement à proximité immédiate de l'os et a progressé au centre dans le temps. Fait intéressant, après plus de 3 semaines la moelle composée de grappes clonales macroscopiques, suggérant la propagation de l'hématopoïèse dérivé de HSPCs individuels contiguë dans la moelle, plutôt que de la diffusion généralisée de HSPCs via la circulation sanguine. Il y avait moins de diversité de couleurs aux points de temps de retard, ce qui suggère des difficultés dans la transduction de repopulation à long terme des cellules avec des vecteurs multiples.
En outre, les groupes HSPCs formé dans la rate, un organe aussi responsable de l'hématopoïèse chez des souris. Cellules individuelles HPSC dérivés pourraient être résolus dans le thymus, les ganglions lymphatiques, la rate, le foie, les poumons, le cœur, la peau, le muscle squelettique, le tissu adipeux, et les reins ainsi. Les images 3D peuvent être évaluées qualitativement et quantitativement pour apprécier la répartition des cellules avec des perturbations minimales des tissus. Enfin, nous illustronsd la faisabilité des études dynamiques vivantes en 4D en combinant résonance multiphotonique à balayage et imagerie confocale time-lapse. Cette méthodologie permet une grande résolution non-invasive, multidimensionnelle cellulaire sort traçage des populations cellulaires spectrale marqués dans leur architecture 3D intact, offrant un outil puissant dans l'étude de la régénération des tissus et de la pathologie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons ici les détails d'une méthodologie puissante récemment conçu pour le suivi des cellules clonales, combinant la grande diversité générée par marquage avec 5FP codant vecteurs Lego et imagerie en tandem microscopie confocale et 2 photons pour atteindre volumétrique et imagerie dynamique dans les tissus vivants combinatoire. Cette étendue d'utilisation du marquage par l'enregistrement de l'identité spectrale confocale à 5 canaux "distincts" 8-bits couleur à base de FP….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Intramural Research Program of the National Heart, Lung, Blood Institute of the National Institutes of Health. We thank Boris Fehse (University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Germany) for providing the five LeGO vector plasmids; Christian A. Combs and Neal S. Young (NHLBI, NIH) for discussions, support and encouragement throughout this study, and Andre LaRochelle (NHLBI, NIH) for assistance with tail vein injections.
Materials
| Production of viruses | |||
| LeGO-Cer2 | Addgene | 27338 | Expression of Cerulean |
| LeGO-G2 | Addgene | 25917 | Expression of eGFP |
| LeGO-V2 | Addgene | 27340 | Expression of Venus |
| LeGO-T2 | Addgene | 27342 | Expression of tdTomato |
| LeGO-C2 | Addgene | 27339 | Expression of mCherry |
| Calciumm Phosphate Transfection Kit | Sigma | CAPHOS-1KT | |
| Tissue culture dish | BD Falcon | 353003 | |
| IMDM | Gibco, Life Technology | 12440-053 | |
| Fetal Bovine Serum Heat Inactivated | Sigma | F4135-500ML | |
| Pen Strep Glutamine | Gibco, Life Technology | 10378-016 | |
| Centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW28 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L60 | |
| Millex Syringe Driven Filter Unite (0.22um) | Millipore | SLGS033SS | |
| Mouse cell collection, purification, transduction and transplantation | |||
| ACK lysing buffer | Quality Biologicals Inc. | 118-156-101 | |
| Lineage Cell Depletion Kit (mouse) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-090-858 | |
| LS columns + tubes | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-306 | |
| Pre-Separation Filters (30um) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-407 | |
| StemSpan SFEM serum-free medium for culture and expansion of hematopoietic cells (500mL) | StemCell Technologies Inc | 9650 | |
| murine IL-11 CF | R & D Systems Inc | 418-ML-025/CF | |
| recombinant murine SCF | RDI Division of Fitzgerald Industries Intl | RDI-2503 | |
| recombinant murine IL-3 | R & D Systems Inc | 403-ML-050 | |
| FLT-3 Ligand | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-096-480 | |
| 12-well plates, Costar | Corning Inc. | 3527 | |
| Retronectin | Takara Bio Inc | T100A/B | |
| Protamine Sulfate | Sigma | P-4020 | |
| Confocal and two-photon microscopy | |||
| DMEM | Lonza | 12-614F | |
| 1M Hepes | Cellgro, Mediatech Inc. | 25-060-CI | |
| Glass bottom culture dish P35G-0-20-C | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | |
| Glass bottom culture dish P35G-0-14-C | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass #1 Borosilicate coverglass; 4-well | Thermo Scientific | 155383 | |
| Leica TCS SP5 AOBS five channels confocal and multi-photon microscope | Leica Microsystems | ||
| Chameleon Vision II -TiSaph laser range 680-1080nm | Coherent | ||
| Chameleon Compact OPO laser range 1030-1350nm | Coherent | ||
| HCX-IRAPO-L 25x/0.95 NA water dipping objective (WD=2.5 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PLAPO-CS 20x/0.70 NA dry objective (WD=0.6 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PL-IRAPO 40x/1.1NA water immersion objective (WD=0.6 mm) | Leica Microsystems | ||
| Imaris software version 7.6 | Bitplane |
References
- Lo Celso, ., C, D. T., Scadden, The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124, 3529-3535 (2011).
- Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
- Takaku, T., et al. Hematopoiesis in 3 dimensions human and murine bone marrow architecture visualized by confocal microscopy. Blood. 116, e41-e55 (2010).
- Malide, D., Metais, J. Y., Dunbar, C. E. Dynamic clonal analysis of murine hematopoietic stem and progenitor cells marked by 5 fluorescent proteins using confocal and multiphoton microscopy. Blood. 120, e105-e116 (2012).
- Weber, K., Mock, U., Petrowitz, B., Bartsch, U., Fehse, B. Lentiviral gene ontology (LeGO) vectors equipped with novel drug-selectable fluorescent proteins new building blocks for cell marking and multi-gene analysis. Gene Ther. 17, 511-520 (2010).
- Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. A multicolor panel of novel lentiviral ‘gene ontology’ (LeGO) vectors for functional gene analysis. Mol Ther. 16, 698-706 (2008).
- Weber, K., et al. RGB marking facilitates multicolor clonal cell tracking. Nat Med. 17, 504-509 (2011).
- Lo Celso, ., Lin, C. P., Scadden, D. T. In vivo imaging of transplanted hematopoietic stem and progenitor cells in mouse calvarium bone marrow. Nature protocols. 6, 1-14 (2011).
- Kohler, A., et al. Altered cellular dynamics and endosteal location of aged early hematopoietic progenitor cells revealed by time-lapse intravital imaging in long bones. Blood. 114, 290-298 (2009).
- Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys J. 82, 493-508 (2002).
- Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119, 238-250 (2012).
