Confocal और Multiphoton माइक्रोस्कोपी का उपयोग पांच फ्लोरोसेंट प्रोटीन द्वारा चिह्नित hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की विवो Clonal ट्रैकिंग में
Summary
Hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं का अंकन मिश्रित 5 फ्लोरोसेंट प्रोटीन उत्थान के दौरान अस्थि मज्जा hematopoietic वास्तुकला में अंतर्दृष्टि प्रदान करने, confocal और दो photon माइक्रोस्कोपी के माध्यम से विवो प्रतिरूप ट्रैकिंग में अनुमति देता है. इस विधि प्रत्यारोपण निम्नलिखित समय की व्यापक अवधि के लिए बरकरार ऊतकों में प्रेतसंबंधी कोडित HSPCs व्युत्पन्न कोशिकाओं के गैर इनवेसिव भाग्य मैपिंग की अनुमति देता है.
Abstract
हम विकसित और murine अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण प्रयोगात्मक मॉडल का उपयोग vivo hematopoiesis में अध्ययन करने के लिए उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (HSPCs) का प्रतिरूप ट्रैकिंग के लिए कार्यप्रणाली अंकन एक फ्लोरोसेंट पुष्टि. फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफपीएस) एन्कोडिंग lentiviral वैक्टर का उपयोग कर अंकन जेनेटिक मिश्रित उन्नत माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के माध्यम से सेल भाग्य मानचित्रण सक्षम होना चाहिए. पांच अलग एफपीएस एन्कोडिंग वैक्टर: आसमानी, EGFP, वीनस, tdTomato, और mCherry रंग चिह्नित कोशिकाओं की एक विविध पैलेट बनाने, समवर्ती HSPCs transduce के लिए इस्तेमाल किया गया. Confocal / दो फोटॉन संकर माइक्रोस्कोपी का उपयोग इमेजिंग एक साथ उच्च संकल्प विशिष्ट चिह्नित कोशिकाओं के आकलन और ऊतकों के संरचनात्मक घटकों के साथ संयोजन के रूप में उनकी संतान में सक्षम बनाता है. बड़ा प्रेतसंबंधी कोडित HSPC व्युत्पन्न कोशिकाओं गैर invasively अस्थि मज्जा सहित विभिन्न बरकरार ऊतकों में पता लगाया जा सकता है कि पता चलता है (बड़े क्षेत्रों पर बी.एम. विश्लेषण करती है), प्रत्यारोपण निम्नलिखित समय की व्यापक अवधि के लिए. 4D में वीडियो दर multiphoton और confocal समय चूक इमेजिंग के संयोजन लाइव पढ़ाई एक मात्रात्मक तरीके से गतिशील सेलुलर और प्रतिरूप ट्रैकिंग की संभावना प्रदर्शित करता है.
Introduction
रक्त कोशिकाओं, करार दिया hematopoiesis के उत्पादन, hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (HSPCs) की एक छोटी सी आबादी द्वारा बनाए रखा है. इन कोशिकाओं को सभी आत्म नवीकरण और भेदभाव 1,2 के नियंत्रण में फंसा, अस्थिकोरक, stromal कोशिकाओं, वसा ऊतकों, और संवहनी संरचनाओं से मिलकर एक जटिल microenvironmental आला में अस्थि मज्जा (बीएम) के भीतर रहते हैं. बरकरार बी.एम. प्रत्यक्ष टिप्पणियों के लिए पारंपरिक रूप से दुर्गम किया गया है, HSPC और उनके microenvironment के बीच बातचीत vivo में काफी हद तक uncharacterized बनी हुई है. इससे पहले, हम confocal प्रतिदीप्ति और प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी 3 का उपयोग बरकरार बी.एम. के 3 डी वास्तुकला कल्पना करने के लिए एक पद्धति की स्थापना की. हम बी.एम. में EGFP चिह्नित HSPCs के विस्तार की विशेषता है, लेकिन केवल एक ही एफपी का उपयोग एक प्रतिरूप स्तर पर उत्थान का विश्लेषण रोका. हाल ही में हम रचनात्मक रूप FL व्यक्त Lentiviral जीन सत्तामीमांसा (लेगो) का लाभ वैक्टर ले लियाuorescent प्रोटीन (एफपीएस) कुशलतापूर्वक कोशिकाओं 4,5 चिह्नित करने के लिए. 3 या 5 वैक्टर साथ HSPC सह पारगमन कई व्यक्ति HSPC क्लोन की ट्रैकिंग की अनुमति, मिश्रित रंग की एक विविध पैलेट उत्पन्न करता है.
चिह्नित HSPC विकिरणित चूहों के बीएम में व्यक्तिगत HSPC घर वापस आना और engraftment का पता लगाने की अनुमति दी नई इमेजिंग तकनीक के साथ संयुक्त. लेगो वैक्टर हड्डी और अन्य के स्पष्ट दृश्य की अनुमति, (आसमानी, EGFP, वीनस, tdTomato, और mCherry से) 3 या 5 विभिन्न एफपीएस के साथ HSPC निशान और confocal और 2 फोटॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा बी.एम. में समय के साथ उनके engraftment पालन करने के लिए इस्तेमाल किया गया मैट्रिक्स संरचनाओं, और उनके microenvironment के घटकों को HSPC क्लोन के संबंध. HSPC लेगो वैक्टर साथ transduced C57BL / 6 चूहों बी.एम. से वंश नकारात्मक कोशिकाओं, के रूप में शुद्ध, और myelo-ablated congenic चूहों में पूंछ नस इंजेक्शन द्वारा reinfused गया. उरोस्थि बी.एम. ऊतक की बड़ी मात्रा की निगरानी करके हम जल्दी में होने वाली endosteal engraftment कल्पनाबी.एम. उत्थान. विविध रंग स्पेक्ट्रा के साथ सेल समूहों की हड्डी के पास शुरू में छपी है और समय के साथ केन्द्र में आगे बढ़े. दिलचस्प है, अधिक से अधिक 3 हफ्तों के बाद मज्जा बल्कि खून के माध्यम से HSPCs के व्यापक प्रसार से, समीप मज्जा में व्यक्तिगत HSPCs से व्युत्पन्न hematopoiesis के प्रसार, सुझाव स्थूल प्रतिरूप समूहों के शामिल. कम रंग विविधता कई वैक्टर के साथ कोशिकाओं repopulating लंबी अवधि transducing में कठिनाई, सुझाव देर समय बिंदुओं पर हुई थी.
इसके अलावा, HSPCs, तिल्ली में चूहों में hematopoiesis के लिए जिम्मेदार भी एक अंग समूहों का गठन. HPSC व्युत्पन्न व्यक्ति की कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह से, थाइमस में लिम्फ नोड्स, तिल्ली, जिगर, फेफड़ों, हृदय, त्वचा, कंकाल की मांसपेशी, वसा ऊतकों, और गुर्दे हल किया जा सकता है. 3 डी छवियों ऊतकों की न्यूनतम perturbations के साथ कोशिकाओं के वितरण की सराहना करने के गुणात्मक और मात्रात्मक आकलन किया जा सकता है. अंत में, हम को वर्णनगुंजयमान स्कैनिंग multiphoton और confocal समय चूक इमेजिंग के संयोजन से 4D में रहते गतिशील पढ़ाई के डी व्यवहार्यता. इस पद्धति ऊतक उत्थान और पैथोलॉजी के अध्ययन में एक शक्तिशाली उपकरण उपलब्ध कराने, उनके बरकरार 3D वास्तुकला में प्रेतसंबंधी चिह्नित कोशिकाओं आबादी के गैर इनवेसिव उच्च संकल्प, बहुआयामी सेल भाग्य अनुरेखण सक्षम बनाता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
हम जीवित ऊतकों में बड़ा और गतिशील इमेजिंग प्राप्त करने के लिए मिलकर confocal और 2 फोटॉन माइक्रोस्कोपी के साथ 5FP एन्कोडिंग लेगो वैक्टर और इमेजिंग के साथ अंकन मिश्रित द्वारा उत्पन्न बड़ी विविधता के संयोजन, यह?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Intramural Research Program of the National Heart, Lung, Blood Institute of the National Institutes of Health. We thank Boris Fehse (University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Germany) for providing the five LeGO vector plasmids; Christian A. Combs and Neal S. Young (NHLBI, NIH) for discussions, support and encouragement throughout this study, and Andre LaRochelle (NHLBI, NIH) for assistance with tail vein injections.
Materials
| Production of viruses | |||
| LeGO-Cer2 | Addgene | 27338 | Expression of Cerulean |
| LeGO-G2 | Addgene | 25917 | Expression of eGFP |
| LeGO-V2 | Addgene | 27340 | Expression of Venus |
| LeGO-T2 | Addgene | 27342 | Expression of tdTomato |
| LeGO-C2 | Addgene | 27339 | Expression of mCherry |
| Calciumm Phosphate Transfection Kit | Sigma | CAPHOS-1KT | |
| Tissue culture dish | BD Falcon | 353003 | |
| IMDM | Gibco, Life Technology | 12440-053 | |
| Fetal Bovine Serum Heat Inactivated | Sigma | F4135-500ML | |
| Pen Strep Glutamine | Gibco, Life Technology | 10378-016 | |
| Centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW28 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L60 | |
| Millex Syringe Driven Filter Unite (0.22um) | Millipore | SLGS033SS | |
| Mouse cell collection, purification, transduction and transplantation | |||
| ACK lysing buffer | Quality Biologicals Inc. | 118-156-101 | |
| Lineage Cell Depletion Kit (mouse) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-090-858 | |
| LS columns + tubes | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-306 | |
| Pre-Separation Filters (30um) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-407 | |
| StemSpan SFEM serum-free medium for culture and expansion of hematopoietic cells (500mL) | StemCell Technologies Inc | 9650 | |
| murine IL-11 CF | R & D Systems Inc | 418-ML-025/CF | |
| recombinant murine SCF | RDI Division of Fitzgerald Industries Intl | RDI-2503 | |
| recombinant murine IL-3 | R & D Systems Inc | 403-ML-050 | |
| FLT-3 Ligand | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-096-480 | |
| 12-well plates, Costar | Corning Inc. | 3527 | |
| Retronectin | Takara Bio Inc | T100A/B | |
| Protamine Sulfate | Sigma | P-4020 | |
| Confocal and two-photon microscopy | |||
| DMEM | Lonza | 12-614F | |
| 1M Hepes | Cellgro, Mediatech Inc. | 25-060-CI | |
| Glass bottom culture dish P35G-0-20-C | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | |
| Glass bottom culture dish P35G-0-14-C | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass #1 Borosilicate coverglass; 4-well | Thermo Scientific | 155383 | |
| Leica TCS SP5 AOBS five channels confocal and multi-photon microscope | Leica Microsystems | ||
| Chameleon Vision II -TiSaph laser range 680-1080nm | Coherent | ||
| Chameleon Compact OPO laser range 1030-1350nm | Coherent | ||
| HCX-IRAPO-L 25x/0.95 NA water dipping objective (WD=2.5 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PLAPO-CS 20x/0.70 NA dry objective (WD=0.6 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PL-IRAPO 40x/1.1NA water immersion objective (WD=0.6 mm) | Leica Microsystems | ||
| Imaris software version 7.6 | Bitplane |
References
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