En Tracking Clonal vivo de madre hematopoyéticas y células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes utilizando confocal y Microscopía Multifotónica
Summary
Combinatorias 5 proteínas fluorescentes de marcado de las células madre y progenitoras hematopoyéticas permite in vivo seguimiento clonal a través confocal y microscopía de dos fotones, que proporciona conocimientos sobre la médula ósea hematopoyética arquitectura durante la regeneración. Este método permite la correlación de destino no invasiva de las células derivadas de HSPCs espectralmente-codificados en tejidos intactos durante largos períodos de tiempo después del trasplante.
Abstract
Hemos desarrollado y validado un marcador fluorescente metodología para el seguimiento clonal de las células madre y progenitoras hematopoyéticas (hspCs) con alta resolución espacial y temporal para estudiar en la hematopoyesis in vivo usando el trasplante de médula ósea modelo experimental murino. Combinatoria genética marcado utilizando vectores lentivirales que codifican proteínas fluorescentes (FPS) permitió la cartografía destino celular a través de imágenes de microscopía avanzada. Vectores que codifican cinco programas marco diferentes: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato y mCherry se utilizaron para transducir simultáneamente HSPCs, creando una paleta diversa de células de color marcado. Imaging utilizando microscopía confocal híbrido / dos fotones permite la evaluación de alta resolución simultánea de las células marcadas de forma única y su progenie en conjunción con componentes estructurales de los tejidos. Volumétrica analiza en grandes áreas revelan que las células derivadas de HSPC espectralmente codificados se pueden detectar de forma no invasiva en diversos tejidos intactos, incluyendo la médula ósea (BM), Durante largos períodos de tiempo después del trasplante. Los estudios en vivo que combinan multifotón-velocidad de vídeo y time-lapse confocal en 4D demuestran la posibilidad de rastreo celular y clonal dinámico de una manera cuantitativa.
Introduction
La producción de células sanguíneas, denominado hematopoyesis, es mantenida por una pequeña población de células madre y progenitoras hematopoyéticas (hspCs). Estas células residen dentro de la médula ósea (BM) en un complejo que consiste nicho microambientales de los osteoblastos, células del estroma, tejido adiposo, y las estructuras vasculares, todos implicados en el control de la auto-renovación y diferenciación 1,2. Como BM intacto ha sido tradicionalmente inaccesibles a la observación directa, las interacciones entre HSPC y su microambiente sigue siendo en gran medida sin caracterizar in vivo. Anteriormente, hemos establecido una metodología para visualizar la arquitectura 3D de BM intacta utilizando fluorescencia confocal y microscopía de reflexión 3. Nos caracteriza expansión de HSPCs EGFP marcados en la BM, pero el uso de sólo una única FP impidió el análisis de la regeneración en un nivel clonal. Muy recientemente nos aprovechamos de la Ontología de Lentiviral Génica (LEGO) vectores que expresan constitutivamente flproteínas fluorescentes (FPS) para marcar eficazmente células 4,5. Co-transducción de HSPC con 3 o 5 vectores genera una paleta diversa de colores combinatorias, lo que permite el seguimiento de los múltiples clones individuales HSPC.
Marcado HSPC combina con la nueva tecnología de imagen permitido trazar homing individuo HSPC y el injerto en el BM de ratones irradiados. LEGO vectores se utilizaron para marcar HSPC con 3 o 5 MF diferentes (desde Cerulean, eGFP, Venus, tdTomato, y mCherry) y seguir su injerto en el tiempo en el BM por microscopía confocal y 2-fotón, lo que permite una visualización clara de los huesos y otra estructuras de matriz, y la relación de clones HSPC a los componentes de su microambiente. HSPC se purificaron como las células negativas de linaje de ratones C57BL / 6 ratones BM, transducidas con vectores LEGO, y vuelve a infundir por inyección en la vena de la cola en ratones congenic mielo-ablación. Mediante el control de grandes volúmenes de tejido BM esternón visualizamos injerto endosteal ocurren temprano enRegeneración BM. Grupos de células con diversos espectros de color aparecieron inicialmente en estrecha proximidad con el hueso y progresaron de forma centralizada a través del tiempo. Curiosamente, después de más de 3 semanas, la médula ósea consiste en agrupaciones clónicas macroscópicas, que indica diseminación de la hematopoyesis derivada de HSPCs individuales de forma contigua en la médula, en lugar de amplia difusión de HSPCs través del torrente sanguíneo. Hubo menos diversidad de color en los puntos finales de tiempo, lo que sugiere la dificultad en la transducción a largo plazo repoblar células con múltiples vectores.
Además, HSPCs formado grupos en el bazo, un órgano también responsable de la hematopoyesis en ratones. Células individuales HPSC derivados podrían resolverse en el timo, los ganglios linfáticos, el bazo, el hígado, los pulmones, el corazón, la piel, el músculo esquelético, tejido adiposo y los riñones también. Las imágenes en 3D pueden ser evaluados cualitativamente y cuantitativamente a apreciar la distribución de células con perturbaciones mínimas de los tejidos. Finalmente, ilustramosd la viabilidad de los estudios dinámicos vivos en 4D combinando multifotón escaneo de resonancia y time-lapse confocal. Esta metodología permite una alta resolución no invasiva, multidimensional celda de destino trazado de las poblaciones de células espectralmente marcados en su arquitectura intacta 3D, proporcionando una poderosa herramienta en el estudio de la regeneración de tejidos y la patología.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se describen aquí los detalles de una metodología poderosa recientemente ideado para el seguimiento celular clonal, la combinación de la gran diversidad generada por el marcado con vectores que codifican LEGO 5PM-y de formación de imágenes confocal con tándem y microscopía de 2 fotones para lograr volumétrica y la imagen dinámica en los tejidos vivos combinatoria. Esto se extendió el uso del color basados en FP marcado por la grabación de la identidad espectral confocal en 5 "distintos" canale…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Intramural Research Program of the National Heart, Lung, Blood Institute of the National Institutes of Health. We thank Boris Fehse (University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Germany) for providing the five LeGO vector plasmids; Christian A. Combs and Neal S. Young (NHLBI, NIH) for discussions, support and encouragement throughout this study, and Andre LaRochelle (NHLBI, NIH) for assistance with tail vein injections.
Materials
| Production of viruses | |||
| LeGO-Cer2 | Addgene | 27338 | Expression of Cerulean |
| LeGO-G2 | Addgene | 25917 | Expression of eGFP |
| LeGO-V2 | Addgene | 27340 | Expression of Venus |
| LeGO-T2 | Addgene | 27342 | Expression of tdTomato |
| LeGO-C2 | Addgene | 27339 | Expression of mCherry |
| Calciumm Phosphate Transfection Kit | Sigma | CAPHOS-1KT | |
| Tissue culture dish | BD Falcon | 353003 | |
| IMDM | Gibco, Life Technology | 12440-053 | |
| Fetal Bovine Serum Heat Inactivated | Sigma | F4135-500ML | |
| Pen Strep Glutamine | Gibco, Life Technology | 10378-016 | |
| Centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW28 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L60 | |
| Millex Syringe Driven Filter Unite (0.22um) | Millipore | SLGS033SS | |
| Mouse cell collection, purification, transduction and transplantation | |||
| ACK lysing buffer | Quality Biologicals Inc. | 118-156-101 | |
| Lineage Cell Depletion Kit (mouse) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-090-858 | |
| LS columns + tubes | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-306 | |
| Pre-Separation Filters (30um) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-407 | |
| StemSpan SFEM serum-free medium for culture and expansion of hematopoietic cells (500mL) | StemCell Technologies Inc | 9650 | |
| murine IL-11 CF | R & D Systems Inc | 418-ML-025/CF | |
| recombinant murine SCF | RDI Division of Fitzgerald Industries Intl | RDI-2503 | |
| recombinant murine IL-3 | R & D Systems Inc | 403-ML-050 | |
| FLT-3 Ligand | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-096-480 | |
| 12-well plates, Costar | Corning Inc. | 3527 | |
| Retronectin | Takara Bio Inc | T100A/B | |
| Protamine Sulfate | Sigma | P-4020 | |
| Confocal and two-photon microscopy | |||
| DMEM | Lonza | 12-614F | |
| 1M Hepes | Cellgro, Mediatech Inc. | 25-060-CI | |
| Glass bottom culture dish P35G-0-20-C | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | |
| Glass bottom culture dish P35G-0-14-C | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass #1 Borosilicate coverglass; 4-well | Thermo Scientific | 155383 | |
| Leica TCS SP5 AOBS five channels confocal and multi-photon microscope | Leica Microsystems | ||
| Chameleon Vision II -TiSaph laser range 680-1080nm | Coherent | ||
| Chameleon Compact OPO laser range 1030-1350nm | Coherent | ||
| HCX-IRAPO-L 25x/0.95 NA water dipping objective (WD=2.5 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PLAPO-CS 20x/0.70 NA dry objective (WD=0.6 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PL-IRAPO 40x/1.1NA water immersion objective (WD=0.6 mm) | Leica Microsystems | ||
| Imaris software version 7.6 | Bitplane |
References
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