In vivo Klon Spårning av hematopoetiska stam och progenitorceller märkta med fem fluorescerande proteiner med hjälp Konfokal och multifoton mikroskopi
Summary
Kombinato 5 fluorescerande proteiner märkning av hematopoetiska stamceller och progenitorceller möjliggör in vivo klon spårning via konfokala och två-foton mikroskopi, som ger inblick i benmärg hematopoetisk arkitektur under regenerering. Denna metod tillåter icke-invasiv öde kartläggning av spektralt Kodade HSPCs-härledda celler i intakta vävnader för långa perioder efter transplantation.
Abstract
Vi utvecklas och valideras en fluorescerande märkning metodik för klonal spårning av hematopoetiska stamceller och progenitorceller (HSPCs) med hög rumslig och tidsmässig upplösning för att studera in vivo blodbildningen med hjälp av murina benmärgstransplantation experimentell modell. Genetisk kombimärkning med hjälp lentivirusvektorer kodar fluorescerande proteiner (fps) aktiverad cell öde kartläggning genom avancerad mikroskopi avbildning. Kodar för fem olika ramprogrammen: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato och mCherry användes för att samtidigt omvandla HSPCs, skapar en mångsidig palett av färg markerade celler. Avbildning med konfokala / två-foton hybrid mikroskopi möjliggör samtidig hög upplösning bedömning av unikt märkta celler och deras avkomma i samband med strukturella komponenter i vävnaderna. Volumetric analyser över stora områden visar att spektralt kodade HSPC-härledda celler kan detekteras icke-invasivt i olika intakta vävnader, däribland benmärgen (BM), Under långa perioder efter transplantation. Live studier som kombinerar video-rate multifoton och konfokal tidsförlopp avbildning i 4D visar möjligheten att dynamiskt cellulär och klonal spårning på ett kvantitativt sätt.
Introduction
Produktionen av blodceller, benämnda hematopoies, underhålls av en liten population av hematopoietiska stamceller och progenitorceller (HSPCs). Dessa celler är bosatta i benmärgen (BM) i en komplex microenvironmental nisch som består av osteoblaster, stromaceller, fettvävnad och kärlstrukturer, alla inblandade i kontrollen av självförnyelse och differentiering 1,2. Som intakt BM har traditionellt varit otillgängliga för direkta observationer, samspelet mellan HSPC och deras mikromiljö är i stort sett uncharacterized in vivo. Tidigare har vi etablerat en metod för att visualisera 3D arkitektur intakt BM använder konfokala fluorescens och reflektion mikroskopi 3. Vi präglas expansion av EGFP-märkta HSPCs i BM, men användningen av endast en enda FP uteslutet analys av regenerering vid en klonal nivå. Helt nyligen vi drog fördel av Lentiviral Gene ontologi (Lego) vektorer konstitutivt uttrycker fluorescent protein (fps) för att effektivt markera celler 4,5. Co-transduktion av HSPC med 3 eller 5 vektorer genererar en mångsidig palett av kombinatoriska färger, vilket gör spårning av flera individuella HSPC kloner.
Märkt HSPC kombinerat med ny bildteknik tillåtet att spåra enskilda HSPC homing och inympning i BM av bestrålade möss. LEGO-vektorer användes för att markera HSPC med 3 eller 5 olika bps (från Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato och mCherry) och följa deras engraftment över tiden i BM av konfokala och två-foton-mikroskopi, vilket möjliggör tydlig visualisering av ben och annan matrisstrukturer, och förhållandet mellan HSPC kloner till komponenter i sin mikromiljö. HSPC renades såsom härstamningen negativa celler från C57BL / 6 möss BM, transducerade med LEGO-vektorer, och återinfuseras genom svansvenen injektion i Myelosuppression ablateras kongena möss. Genom att övervaka stora volymer av bröstbenet BM vävnaden visualiseras vi endosteal engraftment inträffar i början avBM förnyelse. Cell kluster med varierande färgspektra dök ursprungligen i nära anslutning till benet och utvecklats centralt över tiden. Intressant, efter mer än 3 veckor märgen bestod av makroskopiska klon kluster, vilket tyder på spridning av blodbildningen härrör från enskilda HSPCs intill varandra i märgen, i stället för omfattande spridning av HSPCs via blodomloppet. Det var mindre färg mångfald vid sena tidpunkter, vilket tyder på svårigheter att omvandla långsiktiga återinplantering celler med flera vektorer.
Dessutom HSPCs bildat kluster i mjälten, ett organ också ansvarig för hematopoies i möss. HPSC härledda enskilda celler skulle kunna lösas i tymus, lymfkörtlar, mjälte, lever, lunga, hjärta, hud, skelettmuskel, fettvävnad och njure samt. De 3D-bilder kan bedömas kvalitativt och kvantitativt uppskatta fördelningen av celler med minimala störningar av vävnaderna. Slutligen vi illustrerad möjligheten att levande dynamiska studier i 4D genom att kombinera resonant scanning multifoton och konfokala time-lapse avbildning. Denna metod gör det möjligt för icke-invasiv hög upplösning, flerdimensionella cell öde spårning av spektralt markerade celler populationer i deras intakt 3D arkitektur, som ger ett kraftfullt verktyg i studiet av vävnadsregenerering och patologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver här detaljerna i en kraftfull metod som nyligen tagits fram för klonal cell spårning, som kombinerar den stora mångfald som genereras av kombinato märkning med 5FP-kodande Lego vektorer och bildbehandling med tandem konfokala och 2-foton mikroskopi för att uppnå volymetrisk och dynamisk avbildning i levande vävnader. Detta utvidgades användningen av FP-baserade färgmärkning genom att spela in konfokal spektral identitet i fem "distinkta" 8-bits kanaler. Således det relativa förhållan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Intramural Research Program of the National Heart, Lung, Blood Institute of the National Institutes of Health. We thank Boris Fehse (University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Germany) for providing the five LeGO vector plasmids; Christian A. Combs and Neal S. Young (NHLBI, NIH) for discussions, support and encouragement throughout this study, and Andre LaRochelle (NHLBI, NIH) for assistance with tail vein injections.
Materials
| Production of viruses | |||
| LeGO-Cer2 | Addgene | 27338 | Expression of Cerulean |
| LeGO-G2 | Addgene | 25917 | Expression of eGFP |
| LeGO-V2 | Addgene | 27340 | Expression of Venus |
| LeGO-T2 | Addgene | 27342 | Expression of tdTomato |
| LeGO-C2 | Addgene | 27339 | Expression of mCherry |
| Calciumm Phosphate Transfection Kit | Sigma | CAPHOS-1KT | |
| Tissue culture dish | BD Falcon | 353003 | |
| IMDM | Gibco, Life Technology | 12440-053 | |
| Fetal Bovine Serum Heat Inactivated | Sigma | F4135-500ML | |
| Pen Strep Glutamine | Gibco, Life Technology | 10378-016 | |
| Centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW28 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L60 | |
| Millex Syringe Driven Filter Unite (0.22um) | Millipore | SLGS033SS | |
| Mouse cell collection, purification, transduction and transplantation | |||
| ACK lysing buffer | Quality Biologicals Inc. | 118-156-101 | |
| Lineage Cell Depletion Kit (mouse) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-090-858 | |
| LS columns + tubes | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-306 | |
| Pre-Separation Filters (30um) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-407 | |
| StemSpan SFEM serum-free medium for culture and expansion of hematopoietic cells (500mL) | StemCell Technologies Inc | 9650 | |
| murine IL-11 CF | R & D Systems Inc | 418-ML-025/CF | |
| recombinant murine SCF | RDI Division of Fitzgerald Industries Intl | RDI-2503 | |
| recombinant murine IL-3 | R & D Systems Inc | 403-ML-050 | |
| FLT-3 Ligand | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-096-480 | |
| 12-well plates, Costar | Corning Inc. | 3527 | |
| Retronectin | Takara Bio Inc | T100A/B | |
| Protamine Sulfate | Sigma | P-4020 | |
| Confocal and two-photon microscopy | |||
| DMEM | Lonza | 12-614F | |
| 1M Hepes | Cellgro, Mediatech Inc. | 25-060-CI | |
| Glass bottom culture dish P35G-0-20-C | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | |
| Glass bottom culture dish P35G-0-14-C | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass #1 Borosilicate coverglass; 4-well | Thermo Scientific | 155383 | |
| Leica TCS SP5 AOBS five channels confocal and multi-photon microscope | Leica Microsystems | ||
| Chameleon Vision II -TiSaph laser range 680-1080nm | Coherent | ||
| Chameleon Compact OPO laser range 1030-1350nm | Coherent | ||
| HCX-IRAPO-L 25x/0.95 NA water dipping objective (WD=2.5 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PLAPO-CS 20x/0.70 NA dry objective (WD=0.6 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PL-IRAPO 40x/1.1NA water immersion objective (WD=0.6 mm) | Leica Microsystems | ||
| Imaris software version 7.6 | Bitplane |
References
- Lo Celso, ., C, D. T., Scadden, The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124, 3529-3535 (2011).
- Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
- Takaku, T., et al. Hematopoiesis in 3 dimensions human and murine bone marrow architecture visualized by confocal microscopy. Blood. 116, e41-e55 (2010).
- Malide, D., Metais, J. Y., Dunbar, C. E. Dynamic clonal analysis of murine hematopoietic stem and progenitor cells marked by 5 fluorescent proteins using confocal and multiphoton microscopy. Blood. 120, e105-e116 (2012).
- Weber, K., Mock, U., Petrowitz, B., Bartsch, U., Fehse, B. Lentiviral gene ontology (LeGO) vectors equipped with novel drug-selectable fluorescent proteins new building blocks for cell marking and multi-gene analysis. Gene Ther. 17, 511-520 (2010).
- Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. A multicolor panel of novel lentiviral ‘gene ontology’ (LeGO) vectors for functional gene analysis. Mol Ther. 16, 698-706 (2008).
- Weber, K., et al. RGB marking facilitates multicolor clonal cell tracking. Nat Med. 17, 504-509 (2011).
- Lo Celso, ., Lin, C. P., Scadden, D. T. In vivo imaging of transplanted hematopoietic stem and progenitor cells in mouse calvarium bone marrow. Nature protocols. 6, 1-14 (2011).
- Kohler, A., et al. Altered cellular dynamics and endosteal location of aged early hematopoietic progenitor cells revealed by time-lapse intravital imaging in long bones. Blood. 114, 290-298 (2009).
- Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys J. 82, 493-508 (2002).
- Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119, 238-250 (2012).
