Metabolomiks deneylerde sonuçların güvenilirliği numune hazırlama etkinliği ve yeniden üretilebilirlik bağlıdır. Daha sonra bileşikler bin kadar analiz, ya da ilgi sadece bileşik sınıfları seçeneği ile biyolojik sıvılardan metabolitlerin çıkarma sağlayan bir sıkı ve derinlemesine bir yöntem tarif edilmektedir.
Metabolomik biyolojik süreçler hakkında fikir elde etmek amacıyla canlı organizmaların örnekler profilleme sağlayan gelişmekte olan bir alandır. Metabolitler bir önemli yönü tutarsız teknikleri güvenilmez sonuçlar üretmek sayede örnek bir hazırlıktır. Bu teknik, protein çökeltme, sıvı-sıvı ekstraksiyonu, ve dört farklı sınıfa metabolitleri kısımlara ayrılması için bir araç olarak bir katı faz ekstraksiyon kapsar. Duyarlılığında bir artış ile sonuçlanan düşük bolluk moleküllerin geliştirilmiş zenginleştirme elde edilir ve sonuçta moleküllerin daha emin tanımlanmasında sonuçlanır. Bu teknik, plazma, bronkoalveolar lavaj sıvısında ve 50 ul kadar düşük hacimli beyin omurilik sıvısı numune uygulanmıştır. Örnekler çoklu alt uygulamalarda kullanılabilir; örneğin protein çökeltme elde edilen pelet bir sonraki analiz için saklanır. Bu aşamadan gelen süpernatan kullanılarak sıvı-sıvı ekstraksiyonu uğrarsu ve hidrofilik ve hidrofobik bileşikleri ayırmak için güçlü bir organik çözücü içinde eklenmektedir. Parçalanmış sonra, hidrofil tabaka, daha sonra analiz için işlenebilir ya da gerekli değilse atılır. Hidrofobik parça bundan başka yağlı asitler, nötr yağlar, fosfolipidler ve içine ayırmak için, üç katı faz ekstraksiyon adımları sırasında çözücülerin bir dizi ile muamele edilmektedir. Bu teknisyen bileşiklerin sınıf analizi için tercih edildiği seçmek için esneklik sağlar. Ayrıca kimyasal sınıf mevcut bazı bilgi beri daha güvenilir metaboliti belirlenmesine yardımcı olur.
Biyolojik reaksiyonlar hücresel süreçlerin nihai ürünler olarak metabolitler üretmek. Metabolomik Bu işlemlerin bir sonucu olarak bir organizmada mevcut olan tüm bileşiklerin topluluğudur. Bu hücrelerin fizyolojisi bir görüntü sağlar ve içsel veya dışsal uyaranlara 1, 2 bir organizmanın tepkisini yansıtmaktadır. Bu tür uyaranlara, çevresel toksikolojik, farmakolojik, beslenme, hormonal, ya da hastalığa bağlı olabilir. Birçok metabolomic uygulamaları var ve şu anda araştırmacılar tarafından çalışılmaktadır ve biyolojik keşif 3, beslenme çalışmaları 4, gıda bilimi 5 ve uyuşturucu testi 6. içerir. Ne olursa olsun uygulama, veri, kirlenme ve yanlış pozitiflerin mevcudiyetinde varyasyonları azaltılmış ya da tercihan kaldırılması gerekir. Biyobelirtecin keşif veya biyolojik bir f bir kontrol ve bir hastalık grubu arasındaki farklılıkları belirlemek, ya da konularda ilaçların etkilerini araştıran durumundaLUID sorulan sorulara göre seçilir ve metabolitleri türleri 7 araştırılmaktadır. Örneğin, numuneler önce bronkoalveoler lavaj (BAL) metabolitler keşfetmek ve uygulamadan sonra sonra, astımlı akciğerlerdeki bir solunan ilacın hemen etkilerini inceleyerek eğer tercihli olacaktır. Farklar gerçek biyolojik çeşitlilik yerine uygun olmayan örnek hazırlama tekniğine bağlı olarak gözlenen emin olmak için, standart ve tutarlı bir laboratuar protokol 8 gereklidir. Örnek bilgi dikkatle böyle birkaç isim biyolojik sıvının, hayvan zorlanma, örnekleme zaman, konu yaş, cinsiyet gibi değişkenler, tüm kabul ve çalışmaya 9 çarpanlarına sağlamak için dokümante edilmelidir. Buna ek olarak, kirlenme veya yanlış pozitif olasılığını azaltmak için, bu çözücü boşlukları ve enstrüman boşlukları 10 analiz edilmesi tavsiye edilir.
Bu protokol için, dönem "Metabolites "belirlenen gerçek bileşikleri ifade etmek için kullanılacaktır. Satıcı yazılımı kullanarak, bir başlangıç zirve bulma algoritması kütle spektrum zirveleri tespit etmek için kullanılır. Bu tepeler kütle-yük (m / z) oranı ile tutma süresi göre hizalanır. İkinci bir algoritma daha sonra bir tek bir bileşik, birden fazla özelliklerini birleştirmek için kullanılır. Bu, sodyum, potasyum, ya da pozitif iyonizasyon modunda amonyum adüktleri ve negatif iyon modunda klorür gibi özellikleri içerir. Yazılımında ek seçenekler gibi dimerleri ve diğer adüktlerin gibi özellikleri içerir. 181.0707, m / z (M + H) zirveleri ile, bir örnek olarak glikoz kullanarak, 198,0972 m / z (M + NH4) ve 203,05261 m / z (M + Na), aynı tekabül eden üç adet tepe noktası olacaktır İlk algoritması ile bileşik. Moleküler formüle dayanır ikinci algoritması, uygulandığında Ancak Bu üç ilave bileşikleri bir bileşimi elde edilir gruplanmış olur.
Metabolitler samp içinde girişimlere sebep olabilirMevcut bileşiklerin karmaşıklığı nedeniyle les. Bir numune nedenleri metabolitlerinin varlığı bin özellikle alt bolluk metabolitlerin bastırılmasına işaret etmektedir. Örnek temizleme proteinleri müdahale kaldırmak ve birden çok bölüme daha sonra ayrılması, böylece, numune, en yüksek ayrılma iyileştirilmesi artan çözünürlük ve metabolit birlikte elüsyona uğratılmasına azaltılması karmaşıklığını azaltır. Bu nedenle, örnek temizleme ve bileşiklerin geliştirilmiş ayırma gereklidir. Hatta çeşitli kutupluluk çözücülerin kullanımı ile tek başına protein yağış, kanıtlanmıştır, bu meseleyi 11, 12 çözemez. Ancak, fraksiyonasyon sonraki adım MTBE gibi bir güçlü organik çözücü birleştirerek, metabolit kapsama artar. Yang et al. 12 Birleştirilen MTBE solven ekstraksiyonu kullanılarak 3806 metabolitlere, sırasıyla metanol ya da tek başına metanol-etanol çökeltme ile 1851 veya 2073 metabolitlerin bir artış raporKatı faz ekstraksiyonu (SPE) adım izledi. Azaltılmış metabolit örtüşme, geliştirilmiş ayırma ve yüksek tepe metabolit bolluk Bu yöntem ile gözlenmiştir.
Bu gibi polimer olmayan metabolitleri, bulaşma tehlikesi numune toplama, solventler veya alet gürültüye neden olabilir, ve potansiyel olarak önemli metabolitleri sinyal baskılanmasına neden olabilir. Tavsiye edilir teknisyeni (ler) ve hazırlama sürekli aynı marka, tipi ve örnek toplama şişeler, pipet uçları ve numunelerin toplanması ve hazırlama sırasında kullanılan herhangi bir başka tüplerin boyutunu kullanmak örnek önce numuneler edenler. Bu veri analisti gözlenen değişiklikler gerçek ve diğer kaynaklardan gelen arka plan farklılıkları nedeniyle olmadığını, tam güven duymalarını sağlar. Tedavi etkinliği, hastalık ve kontrol gruplarının, veya herhangi bir diğer metabolik analizler arasındaki farklılıklar daha sonra artan güven ile araştırılabilir.
Method Burada ele plazma, BAL sıvısında veya beyin omurilik sıvısı (CSF), sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi (LCMS) göre analiz için non-hedefli metabolomic profil için örnekler uygulanabilir kombine numune hazırlama yöntemleri 13-15 odaklanır. Sıvı kromatografisi (LC) ve ultra-performans sıvı kromatografi Hem (UPLC) ayırma teknikleri, bu prosedür daha sonra MS akuple edilebilir. Metabolomic çalışmalar yapan birçok araştırmacı bir protein çöktürme tekniği ve / veya sıvı-sıvı ekstraksiyon tekniği 16, 17 ya kullanın. Çalışmalarda, bu az metabolitleri tespit sonuçlandı. Burada tarif edilen yöntem, 12 metabolome daha geniş bir aralığını kapsayan, metabolitlerin daha fazla sayıda algılama ve tanımlanmasını sağlar. Bu artış, metabolit sınıfların önce ayrılması neden olduğu örnekleri ve düşük matris etkileri yüksek saflık kaynaklanmaktadır.
Bir ilk protein çöktürme aşaması numuneden proteini uzaklaştırmak için soğuk metanol (MeOH) kullanılarak gerçekleştirilir. Metil tert-butil eter (MTBE) ve su kullanılarak sıvı-sıvı ekstraksiyonu (LLE) hidrofilik ve hidrofobik bileşikleri ayırmak için kullanılır. Yağlı asitler, nötr yağlar, fosfolipidler ve – sonra katı faz ekstraksiyonu (SPE), üç sınıfa hidrofobik bileşikleri ayırmak için bir hidrofobik tabaka üzerinde gerçekleştirilir. Hidrofilik kısımlar su içinde% 5 asetonitril içinde yeniden ise hidrofobik kısımlar,% 100 metanol içinde yeniden edilir. Katı faz ekstraksiyonu (SPE) aşaması, aksi takdirde mevcut olacak birlikte elüt edilen bileşiklerin sayısını azaltarak sonuçlarda güven seviyesi, ilave bir ayırma aşaması gerçekleştirilir olmasaydı sağlar.
Klinik metabolomic çalışmaların bir gol hastalık veya tedavi ile ilgili metabolome değişiklikleri tespit etmektir. Bu nedenle numune hazırlama teknikleri, sağlam, tutarlı ve teknisyen teknisyen ve laboratuvardan laboratuvara 22 aktarılabilir olması gerekir. Edilen veriler örnek temsilcisi olması gerekir, ve tespit değişikliği oldukça numune hazırlama hataları daha ayarlamak örnek yansıtmak gerekir. Dolayısıyla doğru pipetleme, doğru sıcaklık, karışmayan katmanlarının verimli durulaştırmanın, azot altında kurutma ve cam ve ipuçları aynı marka ve boyutlarda kullanılması gereklidir.
Protein çökeltme aşaması sırasında, çözeltinin aynı miktarda her bir pelet boşaltıldı çok önemlidir. Bu hacim değişimini azaltır ve gibi örnek veri değişimini azaltır. Bu protein çöktürme adım metabolomic çalışmalar için gerekli olan ve ondan protein kaldırır beri Atlanamayacaköncesinde, küçük molekül için numuneler kütle spektrometresinde analiz profil. Bu patojenler ve büyük makromoleküllerin ortadan kaldırır ve bültenleri proteinlerden 7 metabolitleri bağlı. Numunelerdeki protein birikimi eksikliği HPLC kolon kullanım genişler ve doğruluk ve sonuç kalitesinin. 5. plazma örneklerinde bu tekniği gerçekleştirirken oluşan protein pelet bir tasvir olan Şekil artırır. Bu, küçük moleküllerin tespiti, iyon bolluk artırır ve numune içinde proteinlerinden matris etkilerini azaltır sağlar. Tüm proteinler, bu aşamada çıkarılır varsayılmıştır Ek olarak,, LC-MS analizi sırasında tespit edilen amino asitler, metabolik değişiklikler yerine protein arıza kaynaklı olacaktır.
Iki karışmayan katmanlar halinde, hidrofilik ve hidrofobik metabolitleri tarafından ayrılmıştır sıvı-sıvı ekstre etme aşaması çok önemlidir. Şekil 6 LLE prosedürü ve bir temsilcisi göstermektedirLLE tabakanın resentation. İki tabakadan bir yanlış ayrılması metabolitleri kaybolma ya da her iki fraksiyonda da elüt edilen iki sonuçlanır. Bu adımın dikkatli uygulama hidrofobik kısmını görünür hidrofilik bileşiklerin sayısını azaltır. Bu temsili sonuçlar içeren fraksiyon tespit edilemez çünkü bu bileşikler için sonuçlar güvenilmez hale gelir. Doğru yapıldığında, metaboliti örtüşme azalır.
Özellikle de lipidler değil, aynı zamanda örneğin, tiol grupları ihtiva edebilir, küçük molekülleri, oksidatif bozulmasını önlemek için, oksijene maruz minimumda tutulmalıdır. Bu nedenle, bu işlem her lipit veya tiol içeren bileşiklerin oksidasyonunu önlemek / azaltmak için azot altında gerçekleştirilir. Buna ek olarak, numune ve / veya çözelti transferi örnekleri hızlı bir şekilde kuruması için, sabit bir nitrojen akışı altında yerleştirilir, daha sonra oksijen maruz kalmasını azaltmak için (ilk dakika içinde) hızlıdır. Kuruduğunda, bunlar derhal vardırrilmesi yukarıda bahsedilen nedenlerden ötürü% 100 metanol içinde yeniden süspansiyon haline getirildi.
Laboratuar bir dizi yolla, bu kapsamlı bir yöntem yararlanabilir; Bileşiklerin bir sınıf izole etmek isteyen araştırmacılar, onların ihtiyaçlarına en uygun yöntemi bölümünü seçebilirsiniz. Sadece metabolitlerin bir havuz elde etmek için bir protein yağış gerçekleştirmek isteyenler bunu yapabilir. Hidrofilik metabolitleri, birçok ilaç, amino asitler ve şekerler veya yalnızca hidrofobik metabolitleri örneğin trigliseritler, epoksitler, yağda çözünen vitaminler, ve örneğin fosfolipidler gibi, arzu edildiği takdirde, daha sonra araştırmacılar, sıvı-sıvı özütleme gerçekleştirmek gibi, arzu edildiği takdirde protein çökeltme aşağıdaki adım ve istenmeyen kısmını atın. Hidrofobik bileşikler (nötr yağlar, yağ asitleri ve fosfolipid) daha fazla alt sınıflandırma gerektiren Araştırmacılar fraksinasyon adımla devam edebilir.
Depolama hususlar maintaini önemlidirDaha sonra analiz için numune canlılığı ng. Örnekler yanlış depolandığı takdirde, bozulma veya ayrışma oluşabilir. İdeal olarak, numune hafif hassas türlerin bozulmasını önlemek için ışıktan uzakta vidalı kapaklı amber şişelerde muhafaza edilmelidir. Örnekler 23-25, aynı zamanda metabolit bozulmasını önlemek için -80 ° C'de donmuş halde muhafaza edilmelidir. Burada ayrıntılı olarak ele rağmen, örnekler her zaman LC-MS analizi sırasında otomatik numune tepsisine 4 ° C'de tutulur. Bu, tüm örnekler, sabit bir sıcaklıkta ve çevre sıcaklığında değişiklikler örneklerin viskozitesi, çözünürlüğünü veya stabilitesini etkilemez tutulmasını sağlar. Bu tür LLE ve SPE olarak bu prosedürün manuel görünümleri, ilgili adımlara güven ve rahatlık sağlamak için uygulanabileceği önerilir.
Birkaç sınırlamalar, bu tekniğin var. Hidrofobik ve hidrofilik metabolitlerinin Gizli ayrılması bazı bileşikler özgü olarak meta olacak gibi garantiently nedeniyle, kimyasal bileşimi ve şarj durumu için her iki bölüme aynlır. Şekil 4, protein topak çıkarma aşaması sırasında uygun olmayan örnekleri ve teknik kalite kontrol hem de zayıf tekrarlanabilirlik metabolit neden olabilir gösterildiği gibi, ek olarak. Istatistiksel güç mevcut değildir, çünkü bu özellikle küçük veri kümelerinde istatistikleri etkiler. Bu nedenle, bu adım, tam olarak her bir örnek için, aynı her zaman gerçekleştirilebilir çok önemlidir. Başka bir sınırlama zamanı. Durak noktaları örnekleri dondurulmuş olabilir ve hazırlık ertesi gün de devam bu protokol boyunca olmasına rağmen, bütün bir gün bu yordamı gerçekleştirmek için kenara olmalıdır. Üçüncü olarak, bir biyolojik numune içinde, her bileşiğin iyon bastırılması için değerlendirilebilir değildir. Bu matris her metaboliti nasıl etkilediğini belirlemek mümkün olmadığından, geçerli seçenek teorik endogenou bazı sınıfları taklit dahili standartlar değerlendirmektirs metabolitleri. Son olarak, mutlak tanımlamalar bu yöntemle sadece gerçekleştirilemez. Veritabanı arama ve standartları ile işbirliği içinde tandem MS mutlak metabolit tespiti için gereklidir.
Metabolitler önemli bir kısmı, bileşimlerinin tanımlanmasıdır. Burada ayrıntılı olarak ele rağmen, kalite kontrol örnekleri LC-MS kullanılarak analiz edildi. Çoklu numune hazırlama boşlukları ve enstrüman boşlukları böylece daha güvenilir bir metaboliti hit sonuçlanan kirliliklerden yanlış pozitiflerin oranını azaltmak için plan çıkarma olarak kullanılmak üzere hazırlanmıştır. Bu etaptan sonra, "moleküler özellikleri" sayısının, m / z, tutma süresi, izotop oranı ve gerçek bileşiklerin bir listesini üretmek için adüktleri esasına dayanan bir araya gruplandırıldı. Bileşiklerin listesi büyük ölçüde azaltılmış olsa da, aynı bileşikten birden fazla ek ürünlerine dayalı değildi gibi, sonuçları daha güvenilir. Tam bir yöntem kapsamlı ve isolatio sağlarBu tür nötr lipidler, fosfolipidler, yağ asitleri, trigliseritler, steroidler, aynı zamanda, sulu fraksiyonda hidrofilik sınıfları izole ederken, bunların eikosanoidlerin, şekerler, flavonoidler ve amino asitler 12 tespit edilmiştir, 26 gibi hidrofobik metabolitlerin n.
The authors have nothing to disclose.
Sunulan öğretici Ulusal Yahudi Sağlık de Kütle Spektrometre Çekirdek Tesis içinde gerçekleştirilen ve geliştirilmiştir. NJH MS tesis CCSTI UL1 TR000154 tarafından kısmen desteklenmektedir. NIH hibe fon P20 HL-113445 ve R01 HL-095432 de bu çalışmaları destekledi.
Acetonitrile | Fisher Scientific | A955-4 | – |
Methanol | Fisher Scientific | L-6815 | – |
Chloroform | Fisher Scientific | C606-1 | – |
Hexane | Sigma Aldrich | 34859 | – |
Acetic acid | Sigma Aldrich | 49199-50ML-F | – |
Methyl tert-butyl ether | J.T. Baker | 9042-03 | – |
Isopropyl alcohol | Sigma Aldrich | 34965-2.5L | – |
Water | Honeywell Burdick & Jackson | 365-4 | – |
OA-SYS heating system | Organomation Associates, Inc | – | Used to keep samples under a constant flow of nitrogen while at 35oC |
12-position vacuum manifold | Phenomenex | – | – |
Strata NH2 (55µM, 70Å) 100mg/mL SPE cartridges | Phenomenex | 8B-S009-EAK | – |
Glass pipette tips | Fisher Scientific | 13-678-20C | Used to transfer sample to SPE column |
Plastic pipette tips | USA Scientific | 1182-1830 | Used when glass tips are not necessary |
1182-8810 | |||
Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | – |
Graduated glass pipets | Fisher Scientific | 13-678-27B | Used to transfer organic solvents during sample prep |
13-678-27E | |||
Pyrex glass culture tubes | Corning Incorporated | 99499-16X | Used to store aqueous and lipid fractions until the next step |
Autosampler vials | Agilent Technologies | 5182-0545 | – |
Snap cap vials for autosampler vials | Agilent Technologies | 5182-0541 | – |
Glass inserts | Agilent Technologies | 5183-2085 | Used for small sample volumes |
Mass Hunter Qualitative Analysis software | Agilent Technologies | Version B.06.00 | Used to monitor retention times and pressure curves |
Mass Hunter Quantitative Analysis software | Agilent Technologies | Version B.05.02 | Used to analyze quality control and sample data |
Mass Profiler Professional software | Agilent Technologies | Version B.12.50 | Used to determine statistics, fold changes, and perform metabolite identification |