Summary
שיטה כדי להעריך את יכולתם של מקרופאגים מכתשיים עכבר בודדים לשלוט על הצמיחה של נבגי אספרגילוס phagocytosed ידי מיקרוסקופיה confocal.
Abstract
הריאות היא ממשק שבו תאי מארח נחשפים באופן שיגרתי לחיידקים ומוצרים של חיידקים. מקרופאגים מכתשיים הם תאי phagocytic הקו הראשון שנתקלים בפטריות בשאיפה וחיידקים אחרים. המקרופאגים ותאים אחרים של מערכת חיסון לזהות את המוטיבים אספרגילוס על ידי קולטנים זיהוי הפתוגן וליזום תגובות דלקתיות במורד הזרם. מונואמין NADPH תא בלען מייצר ביניים חמצן מגיבים (ROIs) והוא קריטי להגנה מארחת. למרות מונואמין NADPH הוא קריטי להגנה מארחת בתיווך נויטרופילים 3 - 1, את החשיבות של מונואמין NADPH במקרופאגים אינה מוגדרת היטב. מטרת המחקר הנוכחי הייתה להתוות את התפקיד הספציפי של מונואמין NADPH במקרופאגים בתיווך הגנת מארחת נגד א ' fumigatus. מצאנו כי מונואמין NADPH במקרופאגים מכתשיים שולט על הצמיחה של א 'phagocytosed fumigatus נבגי 4. כאן אנו מתארים שיטה להערכת היכולת של עכברמקרופאגים lveolar (AMS) לשלוט על הצמיחה של נבגי phagocytosed אספרגילוס (נבגים). מקרופאגים מכתשיים הם מוכתמים בvivo ועשרה ימים לאחר מכן בודדו מעכברים על ידי שטיפה ברונכואלוואולרית (BAL). המקרופאגים הם מצופים על coverslips זכוכית, ולאחר מכן זורעים עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) להביע א נבגי fumigatus. בזמנים שצוינו, תאים הם קבועים ומספר מקרופאגים שלמים עם נבגי phagocytosed נבחנים על ידי מיקרוסקופיה confocal.
Introduction
מקרופאגים מכתשיים הם תאי phagocytic הקו הראשון שנתקלים בחיידקים בשאיפה. המקרופאגים מכירים מוטיבים אספרגילוס על ידי קולטנים זיהוי הפתוגן, לבלוע ולהגביל את הצמיחה של נבגים בשאיפה (נבגים), וליזום תגובות דלקתיות. מונואמין NADPH התא בלען ממיר חמצן מולקולרי לאניון סופראוקסיד ביניים במורד הזרם חמצן מגיבים (ROIs). המחלה granulomatous כרונית (CGD) היא הפרעה תורשתית של מונואמין NADPH מתאפיין בזיהומים חיידקיים ופטרייתיים חמורים ועל ידי תגובות דלקתיות מוגזמות.
למרות מונואמין NADPH הוא קריטי להגנה מארחת בתיווך נויטרופילים 3 - 1, את החשיבות של מונואמין NADPH במקרופאגים אינה מוגדרת היטב. מחקרים קודמים הראו כי מקרופאגים מכתשיים לבלוע ולהרוג נבגי אספרגילוס, בעוד שהנויטרופילים בעיקר למקד את שלב hyphal 5. עם זאת, היו resul סותרts כלתפקיד של מונואמין NADPH במקרופאג בשליטה על הצמיחה של א ' fumigatus נבגי 6, 7.
מטרתה של שיטה זו הייתה להתוות את התפקיד הספציפי של מונואמין NADPH במקרופאגים בתיווך הגנת מארחת נגד א ' נבגי fumigatus. מצאנו כי מונואמין NADPH במקרופאגים מכתשיים שולט על הצמיחה של א 'phagocytosed fumigatus נבגי 4. למודל תגובת המארח לפטריות בשאיפה באופן הדוק ביותר, השתמשנו מקרופאגים מכתשיים שנקטפו על ידי שטיפה ברונכואלוואולרית מעכברי unstimulated הבא להקריב באופן מיידי. שימוש במקרופאגים מכתשיים מבודדים אפשרו לנו להתמקד בפעילות נגד פטריות שלהם בהיעדרם של תאים חיסוניים אחרים (למשל נויטרופילים שגויסו,) שלהתגונן מפני אספרגילוס in vivo. בשיטה זו, מקרופאגים מכתשיים הוכתמו in vivo לפני קציר, כדי למזער את הכמות של מניפולציה לאחר קטיף. </ P>
יתרון נוסף לפרוטוקול זה הוא השימוש בא-GFP-לבטא זן fumigatus. פטרייה זו מבטאת GFP משלב הנבגים דרך שלב hyphal ואין לו צורך בצביעה נוספת. כדי להשיג תמונות עם פירוט רב יותר, בחרנו מיקרוסקופיה confocal המאפשרת הבנייה מחדש של מבנים תלת ממדיים מהתמונות שהושגו. שחזור תלת ממדי נותן את היכולת להבדיל בין העובש גדל בסביבה ולא באו באמצעות מקרופאג. נבגים יכולים להיות גם בדיוק מכובדים כתאי לעומת תאי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים שבוצעו בבעלי חיים במחקר זה אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים והשימוש בRoswell Park Cancer Institute ועמדו בכל המדינה, הפדרלית, והמכון הלאומי לתקנות בריאות.
1. בvivo Macrophage תיוג
הערה: PHK26 הוא צבע lipophilic שיינקט על ידי תאי phagocytic גם במחזור וברקמות, כאשר בהזרקה לווריד (IV). PKH26 שימש לסימון in vivo כדי למזער את הכמות של מניפולציה לאחר הקטיף של מקרופאג. יש PKH-26 היתרון של יציבות צבירה במקרופאגים מכתשיים לאורך תקופות ממושכות. מחכה 10 ימים לאחר מתן מאפשר סליקה של כל התאים שכותרתו ממחזור ומשאירים רק מכתשיים מקרופאג שכותרתו ביציבות עם PKH26 8, 9. PKH26 הוא fluorochrome אדום שיש עירור (551 ננומטר) ופליטת מאפיינים (567 ננומטר) תואמיםעם מערכות rhodamine או זיהוי phycoerythrin. כל הליך תיוג יכול להציג את החפץ, לרבות אובדן יכולת הקיום. עם זאת, מאחר שאנו משתמשים באותה הגישה לתיוג של מקרופאגים בגנוטיפים עכבר שונים (למשל, WT לעומת NADPH אוקסידאז לקוי), את ההשפעות של חפצים אלה יהיו אחידות.
- לדלל פתרון מניות של PKH26 (1 x 10 -3 M באתנול) 1:05 ב-C diluent המסופק על ידי יצרן.
- של PKH26 דילול עומס 100 μl לתוך מזרק 1/2 מיליליטר אינסולין (29 G x 1/2 ") לכל עכבר.
- לנהל לעכברים בהזרקת IV (או וריד זנב או מסלולית רטרו) 10 ימים לפחות לפני הקציר.
2. קציר מכתשיים המקרופאגים על ידי שטיפה ברונכואלוואולרית (BAL)
מספר העכברים לשימוש עבור ניסוי יכול להשתנות. תשואה אופיינית מעכבר unstimulated היא בטווח של 3-5 x 10 5 מקרופאגים מכתשיים, אולם מספר זה יכול להשתנות במידה רבה BASאד בגורמים כגון גודל של העכבר, החוויה של האדם שבצע את שטיפה, ומספר instillations של נוזל שטיפה והנפח נסוג מריאות. בפרוטוקול זה שטיפת ריאות מתבצעת עם חלל בית החזה סגור אשר יחד עם lavages 1 מיליליטר חוזר ונשנה עוזר להגדיל את תשואת תא.
- להרדים את עכבר על ידי מתן מנה קטלנית של חומר ההרדמה Avertin (12.5 מ"ג) intraperitoneally (IP) באמצעות תנאים אספטיים כדי לשמור על התמיסה סטרילית.
- ספריי עכבר ביסודיות עם 70% אתנול.
- הסר את העור מקצה הגולגולת של בעלי חיים וחושפים את בית החזה (איור 1 א).
- לעשות חתך קטן בעור ממש מתחת לסרעפת.
- הכנס את האצבע לתוך החתך ולמשוך את עור מקצה הגולגולת של (איור 1 א) לבעלי החיים.
- לדחוף את מעט על הראש, המשתרע בצד הגחוני של הצוואר (איור 1 א).
- לחתוך חור קטן שדרך כלוב הצלעותלצד הימני של בית החזה כדי להוציא את האוויר לריאות וגם לאפשר הדמיה של ריאות במהלך השלבים הבאים.
- אתר את קנה הנשימה, ובזהירות לנתח משם רקמה שמסביב.
- הסר את בלוטות רוק, שרירי sternohyoid וגרון, וכו 'עם מלקחיים מעוקלים.
- בזהירות להרים עם מלקחיים מעוקלים ולחתוך עם מספריים הרקמה דקה המכסה את קנה הנשימה (adventitia) לחשוף את מבנה סחוס טבעתי שבבסיס.
- הכנס קטטר לתוך קנה הנשימה.
- באמצעות מלקחיים מעוקלים, הנח תפר מאחור (גב ל) קנה הנשימה ולשלוף אורך 10 סנטימטר דרך הפתח.
- החל מעל cricoid (הטבעת המעובה של סחוס) ינחה בזהירות קטטר G 22 המורד קנה הנשימה לעצור בו את קנה הנשימה נעלמת מאחורי עצם החזה.
- בתוקף לקשור תפר סביב קנה הנשימה וקטטר להתאמה הדוקה. הסר את המחט מקטטר.
- להרכיב ברזלים 4 כיוונים.
- למלאאחד 6 מיליליטר המזרק עם DPBS, FBS 1% ולצרף לברזלי 4 כיוונים כפי שמצוין באיור 1.
- צרף מזרק מיליליטר ריק 6 במיקום מצויינים על ברזלים 4-way (איור 1).
- צרף נמל פתוח בברזלים 4-דרך קטטר (איור 1). היזהר שלא לסלק קטטר מקנה הנשימה.
- לאסוף שטיפת נוזלים מריאות.
הערה: חוקרים יכולים לבחור להשתמש בכמויות נמוכות יותר של נוזל שטיפה כדי למזער את האפשרות של נזק לרקמות. זה חשוב כי באותה הגישה יש ליישם באופן עקבי בכל קבוצות העכבר.- סובב את הידית על ברזלים כך המזרק הריק סגור ולאט להזריק DPBS ~ 1 מיליליטר, 1% FBS לנפח את הריאות. שים לב לאינפלצית ריאה דרך החור בשלב 2.4.
- היזהר שלא overinflate הריאות.
- סובב את הידית על ברזלים, כך שהמזרק המלא סגור, ולסגת בזהירות השפעת id מהריאות.
- שים לב לריאות להוציא את האוויר דרך החור בשלב 1.4. קטטר ייתכן שיצטרך להזיז מעט אחורה או אחורה כדי לקבל הגרלה טובה. לנקוט אמצעי זהירות מיוחדת כדי לשמור את הקטטר בתוך קנה הנשימה.
- חזור על שלבים 2.8.1-2.8.4 5-6x עד שכל DPBS, 1% FBS כבר הזריק ונסוג מהריאות. הערה: התאוששות של ריאות נוזל לא תהיה של נוזל מוזרק 100%.
- מזרק ריק עם נוזל שטיפה לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר. לשמור על תאים בטמפרטורת חדר.
- גלולה תאים על ידי צנטריפוגה XG 300 5 דקות בטמפרטורת חדר ויוצקים את supernatant. זו ניתן לשמור לניתוח ציטוקינים אם תרצה בכך.
- Resuspend תאים ב1-5 מיליליטר RPMI 1640 עם FBS 10% ולסמוך על hemocytometer. בעכבר unstimulated,> 95% מתאים שנקטפו על ידי BAL צפויים להיות מקרופאגים, אשר יכול להיות מאושר על ידי ציטולוגיה.
3. Culturing וקציר פטרייה
"> Fumigatus Aspergillus שימוש בפרוטוקול זה מבטא GFP בכל שלבי מחזור החיים שלו:. נבגים, germlings ועובש פטרייתי זן זה הניתן על ידי ד"ר מרגו מור, אוניברסיטת סיימון פרייזר, Burnaby, BC, קנדה.- נבגי צלחת של מתח fumigatus Aspergillus להביע GFP בעירוי לב מוח Sabouraud (BHI) אגר שיפועים עם Chloramphenicol (0.05 גר '/ ל') וגנטמיצין (0.5 גר '/ ל').
- דגירה בחושך כתרים באופן רופף ל7-10 ימים בטמפרטורת חדר.
- קציר נבגים על ידי אלכסון כביסה עם 10 מיליליטר של 0.01% Tween 20 בDPBS. קל לגרד את הפטרייה עם stripette כדי לשחרר. יש לשטוף את השיפוע מספר פעמים כדי להגדיל את התשואה.
- עובר השעיה נבגים דרך מסננת תא 100 מיקרומטר ל50 מיליליטר חרוטי.
- גלולה נבגים על ידי צנטריפוגה ב XG 400 10 דקות.
- נבגי resuspend ב 50 DPBS מיליליטר ולספור באמצעות hemocytometer.
- שטוף פעמיים עם DPBS ולדלל את ריכוזים רצוייםטיפול במשפחה.
4. פטרייתיים אתגר ומיקרוסקופיה confocal
כדי לחקור את התפקיד של מונואמין NADPH מקרופאג בהגנת מארחת, את היכולת של מקרופאגים מכתשיים מבודדים מעכברים של שלושה גנוטיפים לשלוט על הצמיחה של נבגי אספרגילוס phagocytosed הוערכה. גנוטיפים השתמשו במחקר זה כוללים; 1) wild-type עכברים, 2) Ncf1 * / * Mn-עכברים עם מוטציה Ncf1 טבעית (Ncf1 מקודד לphox p47, רכיב הנדרש של מונואמין NADPH תא בלען) ומשאיר אותם חסר מונואמין NADPH, ו3) Ncf1 * / * Mn + עכברים הטרנסגניים (MN מציין transgene מחסה wildtype Ncf1 תחת השליטה של אמרגן CD68 אדם) שבו פעילות מונואמין NADPH כבר מחדש באוכלוסיית מונוציטים / מקרופאג 10, 11.
מיקרוסקופיה confocal היא מתאימה ביותר עבור assay זה בשל נוכחותםוצמיחה של נבגים שאינם phagocytosed בשקופיות. מיקרוסקופ confocal יאפשר להדמיה של מטוסים בודדים בתוך ציר ה-Z, ולאפשר הבחנה בין הפטרייה גדלה בסביבה ולא בתוך מקרופאג. כל תמונות confocal נרכשות באמצעות עדשת טבילת שמן 63X. Z-ערימות נרכשות עם גורם הזום אלקטרוני של 2.5. העובי של Z-מחסנית נקבע באמצעות DAPI ותמונות שדה בהירים כדי לאתר את החלק העליון ותחתון של השדה. Z-ערימות נעו 14-24 מיקרומטר עם פרוסות בודדות ~ 1 מיקרומטר עבה. לכימות של מקרופאגים, סריקות יחידה של זום האלקטרוני 1X בוצעו על 10 שדות לכל גנוטיפ. מקרופאגים ללא פגע זוהו מבוסס על PKH26 ומכתים DAPI של הקרום וגרעין בהתאמה. נבגים זוהו מבוסס על ביטוי FITC ותמונת שדה בהיר.
- הכן את coverslips וצלחות סטרילי
- תחת ארון בטיחות ביולוגית, לספוג 22 x 22 coverslips זכוכית מ"מ בethano 70%l ל5-10 דקות.
- יש לשטוף coverslips ב PBS סטרילית.
- בעזרת מלקחיים סטרילית, מניח בעדינות coverslip יחיד בתחתית היטב בכל צלחת 6 היטב ארוזה בנפרד סטרילי.
- זרע ~ 1 x 10 6 נקטף PKH26 כותרת מקרופאגים מכתשיים מושעים ב300 μl RPMI 1640, FBS 10% על כל coverslip. המספר המדויק עשוי להשתנות תלוי בתשואת הקציר.
- לאפשר מקרופאג לדבוק ידי דוגרים על 37 ° C עם 5% CO 2 בלילה.
- למחרת בבוקר, להוסיף ~ 1 x 10 7 א-GFP-לבטא נבגי fumigatus מושעים ב100 μl RPMI 1640, 10% FBS (37 מעלות צלזיוס) מחומם מראש.
- להחזיר את צלחת לאינקובטור 37 ° C עם 5% CO 2.
- תאים צריכים להיות קבועים למשך התקופה מינימאלית של 2 שעות בטמפרטורת חדר או הלילה ב 4 ° C. בבית 3, 7, ו14 תאים לתקן את שעה על ידי הוספת נפח שווה של פורמלדהיד 2% לכל טוב (ריכוז סופי פורמלדהיד 1%). צלחות מקוםנקודות זמן המוקדם ב 4 ° C למשך הלילה. לנקודת הזמן הסופית (14 hr), לתקן את התאים בטמפרטורת חדר למשך 2 שעות.
- לאחר קיבוע, בעדינות להסיר coverslips באמצעות מלקחיים ולשטוף בDPBS.
- להסיר את הנוזלים עודפים על ידי הצבת קצה coverslip על Kimwipe מקופל.
- החל 6 הרכבה בינונית הקרינה μl עם DAPI לשקופית הזכוכית מיקרוסקופ.
- הנח קצה אחד של coverslip בשקופית ובעדינות שחרר עם צד תא למטה להרכבה בינונית. הרכבה בינונית תתפשט ויוצר שכבה אחידה מתחת coverslip. אין צורך ללחוץ על coverslip.
- לאטום קצוות של coverslip עם לק ברור ולאפשר לאוויר יבש.
- חנות שקופיות מוכנה בקופסא שקופיות (המוגנת מפני אור) בטמפרטורת חדר עד מוכן לנתח על ידי מיקרוסקופיה confocal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איסוף מקרופאג מכתשיים ידי BAL מעכברי unstimulated יגרום> 95% מאוכלוסייה טהורה המבוססת על ציטולוגיה. 3 ו 7 שעות (איור 2) נקודות זמן להקדים את שלב hyphal של פטרייתי צמיחה ולאפשר השוואה של יעילות phagocytic של נבגים בין גנוטיפים. נקודת הזמן 14 שעות היא שבו ניתן להשוות גנוטיפים בכל קשור ליכולת לעכב את המעבר של נבגי phagocytosed לבמה hyphal רקמות פולשנית (איור 3). מקרופאג השלם יכול להיות מזוהה על ידי מיקרוסקופיה confocal המבוסס על כתמי PKH26 וDAPI של הקרום והגרעין, בהתאמה (איורים 2 ו -3). נבגי העובש ומזוהים המבוססים על הביטוי של GFP (איורים 2 ו -3).
"/> Iles/ftp_upload/51678/51678fig1.jpg
איור 1. הפניות אנטומי כיוונית ו4-Way ברזלים.) אזכור כיוונית אנטומיים לעכבר מוצגות. גולגולת היא בכיוון של הראש, ואילו הזנב הוא לכיוון הזנב. הצד הגחוני של הולך על ארבעה הוא לכיוון הבטן או המשטח נמוך יותר של בעלי החיים, ואילו בצד הגבי הוא לכיוון הגב או על פני השטח העליונים של בעלי חיים. ב ') יש לו ברזלים 4 הכיוונים שלושה חיבורי luer וידית שמסתובבת 360 ° לכוון את זרימת הנוזלים דרך ברזלים. מיקום של המזרק הריק, מזרק המלא וקטטר מצוינים. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. Phagocytosis של א ' נבגי fumigatus דומים בין גנוטיפים ב7 שעות. כדי להעריך את יכולתם של מקרופאגים מכתשיים מבודדים עם פעילות מונואמין NADPH להגביל את הצמיחה של נבגי phagocytosed, () סוג פראי, (ב) Ncf1 * / * Mn +, ו (ג ) Ncf1 * / * Mn - עכברים ניתנו PKH26 iv. מקרופאגים מכתשיים נקצרו על ידי BAL 10 ימים לאחר מכן וזורעים עם נבגים של א '-GFP-לבטא fumigatus. תאים היו קבועים בשעה 3, 7, ו14 שעות לאחר תוספת של נבגים. בשעת 3 (מידע לא מוצג) ו -7 שעות הן את המספר של מקרופאגים הכולל ומקרופאג עם ≥ 1 phagocytosed נבגים (חיצים) היו דומים בין שלושה גנוטיפים, המשקף את יעילות phagocytosis דומה. מקרופאגים ללא פגע מזוהים מבוססים על PKH26 (אדום) וDAPI מכתים (כחול) של קרוםגרעיני nd בהתאמה. תמונות הקרינה מZ-מטוס אחד הם כיסו עם תמונת השדה בהירה. תמונת השדה הבהיר מורכבת של אור מועבר באמצעות כל הדגימה ולכן כאשר overlain על Z-רגיל הניאון מאפשרת הדמיה של תאים ונבגים בתוך Z-המחסנית שלמה. סרגל קנה מידה, 19 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. Macrophage מונואמין NADPH נדרש לשלוט על הצמיחה של א ' . נבגי fumigatus מיקרוסקופיה confocal של (A, D) wild-type, (B, E) Ncf1 * / * Mn +, ו( C, F) Ncf1 * / * Mn - < / Sup> מקרופאג מכתשיים ב14 שעות לאחר זריעה עם GFP + A. נבגי fumigatus. מקרופאגים ללא פגע מזוהים מבוססים על PKH26 (אדום) וDAPI מכתים (כחול) של קרומים וגרעינים, בהתאמה. חיצים מוצקים להראות מקרופאגים שלמים עם נבגים לפחות אחד phagocytosed וחצים חלולים מצביעים על העובש. אדמיניסטרטיבים רבים עם לפחות 1 phagocytosed נבגים נצפו עם * / * Mn + תאי wild-type ו Ncf1, אבל לא עם תאי מונואמין הלקוי NADPH. אות ה-GFP בעובש הייתה משתנה המבוססת על המטוס של הדימוי מוערם z שמוצג. AC) תמונות הקרינה מZ-מטוס אחד עם תמונת השדה הבהיר מאפשר ויזואליזציה של תאים ועובש בתוך Z-המחסנית שלמה. תמונות הקרינה) DF מZ-מטוס בודד ללא רקע בתחום הבהיר מאפשר זיהוי של תאים, אך לא את הקשר המרחבי של תאים ופטריות בZ-מטוסים שונים. סרגל קנה מידה, 19 מיקרומטר..jove.com/files/ftp_upload/51678/51678fig3highres.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השימוש בגישה זו לניתוח vivo לשעבר של הפעילות נגד פטריות של מקרופאגים יחד עם אתגר פטרייתי in vivo, שהוכחנו בעבר כי מונואמין NADPH במקרופאגים ממלא תפקיד חשוב בהגנה מפני א 4 fumigatus. שימוש במקרופאגים מכתשיים מבודדים מאפשרים לנו להתמקד בפעילות נגד פטריות שלהם בהיעדרם של תאים חיסוניים אחרים (למשל, גייס את הנויטרופילים) שלהתגונן מפני אספרגילוס in vivo.
אסטרטגיות להדמיה שונות שימשו להערכת פעילות נגד פטריות מקרופאג in vivo לשעבר vivo. לותר et al., המשמש מיקרוסקופיה confocal ללמוד phagocytosis של נבגי אספרגילוס ידי אדם (שנקטפו ממושתלי ריאה) ואדמיניסטרטיבים עכבר 12. Geunes-ויאר et al. אפיין את האינטראקציה בין קנדידה krusei ומקרופאגים העכבריים הבא phagocytosis. הםמשמש קו מקרופאג תא, RAW264.7 ומקרופאג העיקרי מ13 הצפק. גרסיה Rodas et al. הראה כי שטח חלבון-D נקשר ולמקל phagocytosis וההישרדות של neoformans Cryptococcus 14. / - - SP-D מחייב נחקר גם in vivo באמצעות SP-D עכברי intranasally מחוסן עם אלקסה פלואוריד ג 488 כותרת neoformans. בעקבות שטיפת ריאות, AMS תויגו immunofluorescently ומיקרוסקופיה confocal שימשה לנתח phagocytosis.
המקרופאגים מאתרים שונים אנטומיים (למשל מכתשיים, הטחול, הצפק), שנוצרו עם גירויים שונים (למשל, thioglycollate ההתמחרות או בהתמיינות חוץ גופית), או משורות תאים (לדוגמא, RAW264.7) יכול להיות תגובות מיקרוביאלית ודלקתיות שונות באופן דרמטי 15 - 18. לכן, למודל תגובת המארח לכיף בשאיפה באופן הדוק ביותרGI, השתמשנו מקרופאגים מכתשיים שנקטפו על ידי שטיפה ברונכואלוואולרית מעכברי unstimulated הבא להקריב באופן מיידי.
בתחילה השתמשנו בהדמיה לחיות תאים כדי להעריך פעילות נגד פטריות מקרופאג 4. מקרופאג מכתשיים היו מצופים בשקופיות זכוכית נאוטילוס אז נזרע עם GFP להביע אספרגילוס. לאחר 3 שעות, נבגים שאינם phagocytosed הוסרו על ידי כביסה עדינה כדי לאפשר להדמיה ישירה של נבגי phagocytosed. נביטת נבגים הייתה אז פיקוח על ידי הדמיה הזמן לשגות ב30 מרווחי דקות שימוש בתמונות אור בהירים לדמיין מקרופאג וקרינת ה-GFP כדי להמחיש פטריות. בשיטה זו יש את היתרון של רכישת תמונות רציפה של אותה תרבות התא הראשונית. עם זאת, הנטייה למקרופאג להגר על פני שדה הראייה במהלך הרכישה אפשרה לאיכותי ולא הערכה כמותית של פעילות conidiocidal. חסרון נוסף של הדמיה לחיות תאים הוא לאהוא חוסר הבהירות והפירוט כתאים לנוע ולצאת מהמטוס של מוקד.
כדי להשיג תמונות עם פירוט רב יותר בחרנו מיקרוסקופיה confocal המאפשרת הבנייה מחדש של מבנים תלת ממדיים מהתמונות שהושגו. שחזור תלת ממדי נותן את היכולת להבדיל בין העובש גדל בסביבה ולא באו באמצעות מקרופאג. עם היכולת הזו כדי לראות את התאים ופטריות בשלושה ממדים, הסרת הנבגים שאינם phagocytosed ב3 שעות היא כבר לא צעד הכרחי. נבגים יכולים להיות גם בדיוק מכובדים כתאי לעומת תאי.
להדמיה משופרת, מקרופאג מכתשיים תויגו in vivo עם PKH26. יש צבע פלואורסצנטי זה זנב אליפטי ארוך אשר משלב יציבות לאזורי השומנים של קרום תא. כאשר הוא מוזרק לווריד, צבע lipophilic זה הוא נלקח על ידי תאי phagocytic הן בזרם הדם וברקמות. לאחר 10 ימים, Labephagocytes הוביל נמחקים ממחזור עכברי ויישאר רק ברקמות 9, המאפשר לאוסף של מקרופאג מכתשיים שכותרתו כבר על ידי BAL. עם השימוש בתיוג in vivo, מניפולציה לאחר קטיף של מקרופאגים מכתשיים ממוזערים.
יתרון נוסף לפרוטוקול זה הוא השימוש בא-GFP-לבטא זן fumigatus. פטרייה זו מבטאת GFP משלב הנבגים דרך שלב hyphal ואין לו צורך בצביעה נוספת. עם צביעה כפולה של מקרופאגים ואספרגילוס, אנו מסוגלים לזהות נבגי phagocytosed.
גורם מגביל בפרוטוקול זה הוא תשואת מקרופאג מBAL. תשואה אופיינית מעכבר unstimulated היא בטווח של 3-5 x 10 5 מקרופאגים מכתשיים, אולם מספר זה יכול להשתנות במידה רבה בהתבסס על גורמים כגון גודל של העכבר, החוויה של האדם שבצע את שטיפה, ומספר instillations של שפעת שטיפהid והנפח נסוג מריאות. בפרוטוקול זה, שטיפת ריאות מתבצעת עם חלל בית החזה סגור אשר יחד עם instillations 1 מיליליטר חוזר ונשנה עוזר להגדיל את תשואת תא בהשוואה לחלל בית החזה פתוח ופחות instillations. יכולים גם להיות מוגברים מספרי עכבר כדי להגדיל את תשואת קציר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לאלרגיה והמחלות מדבקות גרנט R01AI079253 (לBHS), ועל ידי המכון הלאומי לסרטן סרטן מרכז תמיכת גרנט CA016056 לRoswell Park Cancer Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma | PKH26GL-1KT | |
| 2,2,2 Tribromoethanol | Sigma | T48402 | Used to make AvertinAnesthetic |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma | A-1685 | Used to make AvertinAnesthetic |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium) | Corning | 21-031-CV | |
| NH4Cl | Sigma | A0171 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
| KHCO3 | Sigma | P91444 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
| EDTA | Sigma | E6758 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
| 22 G x 1.00 inch i.v. catheter | BD | 381523 | Insyte Autoguard Winged |
| Insulin syringes | |||
| 6 ml Syringes | |||
| 4-way stopcock | Fisher Scientific | 50-700-077 | |
| Suture thread | |||
| 50 ml conical centrifuge tubes | |||
| gauze sponges (4 inch square) | |||
| RPMI 1640 with L-glutamine | Corning | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | heat inactivated |
| Hema 3 Stain Set | Fisher Scientific | 22-122-911 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | |
| Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants | BD | 297252 | |
| Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein | provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada | ||
| 100 μm Cell strainers | BD Falcon | 64753-00 | |
| Scissors | |||
| Forceps | |||
| Biological Safety Cabinet Class II | |||
| Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor | |||
| Leica DM1000 light microscope | |||
| Hemocytometer | |||
| Cytospin 2 centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Cell culture incubator | 37 °C, 5% CO2 | ||
| 22 x 22 mm micro cover glass | VWR | 48366-227 | glass coverslips |
| 6-well Cell culture plates | Corning | 3506 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | BDH0502-1LP | |
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Leica TCS SP2 system with a laser point scanner | Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope |
References
- Reeves, E. P., et al. Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux. Nature. 416, 291-297 (2002).
- Bianchi, M., et al. Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis. Blood. 114, 2619-2622 (2009).
- Vethanayagam, R. R., et al. Role of NADPH oxidase versus neutrophil proteases in antimicrobial host defense. PLoS One. 6, (2011).
- Grimm, M. J., et al. Monocyte- and Macrophage-Targeted NADPH Oxidase Mediates Antifungal Host Defense and Regulation of Acute Inflammation in Mice. The Journal of Immunology. 190, 4175-4184 (2013).
- Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes. J Clin Invest. 69, 617-631 (1982).
- Philippe, B., et al. Killing of Aspergillus fumigatus by alveolar macrophages is mediated by reactive oxidant intermediates. Infect Immun. 71, 3034-3042 (2003).
- Cornish, E. J., et al. Reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase-independent resistance to Aspergillus fumigatus in alveolar macrophages. J Immunol. 180, 6854-6867 (2008).
- Jennings, J. H., Linderman, D. J., Hu, B., Sonstein, J., Curtis, J. L. Monocytes recruited to the lungs of mice during immune inflammation ingest apoptotic cells poorly. Am J Respir Cell Mol Biol. 32, 108-117 (2005).
- Davidson, B. A., et al. DISCRIMINATION OF RESIDENT AND INFILTRATED ALVEOLAR MACROPHAGES BY FLOW CYTOMETRY IN INFLUENZA A VIRUS-INFECTED MICE. Experimental Lung Research. 31, 323-339 (2005).
- Gelderman, K. A., et al. Macrophages suppress T cell responses and arthritis development in mice by producing reactive oxygen species. J Clin Invest. 117, 3020-3028 (2007).
- Pizzolla, A., et al. Reactive oxygen species produced by the NADPH oxidase 2 complex in monocytes protect mice from bacterial infections. J Immunol. 188, 5003-5011 (2012).
- Luther, K., et al. Characterisation of the phagocytic uptake of Aspergillus fumigatus conidia by macrophages. Microbes and Infection. 10, 175-184 (2008).
- Geunes-Boyer, S., et al. Surfactant Protein D Increases Phagocytosis of Hypocapsular Cryptococcus neoformans by Murine Macrophages and Enhances Fungal Survival. Infection and Immunity. 77, 2783-2794 (2009).
- García-Rodas, R., González-Camacho, F., Rodríguez-Tudela, J. L., Cuenca-Estrella, M., Zaragoza, O. The Interaction between Candida krusei and Murine Macrophages Results in Multiple Outcomes, Including Intracellular Survival and Escape from Killing. Infection and Immunity. 79, 2136-2144 (2011).
- Ryan, L. K., Vermeulen, M. W. Alveolar macrophages from C3H/HeJ mice show sensitivity to endotoxin. Am J Respir Cell Mol Biol. 12, 540-546 (1995).
- Redente, E. F., et al. Differential polarization of alveolar macrophages and bone marrow-derived monocytes following chemically and pathogen-induced chronic lung inflammation. J Leukoc Biol. 88, 159-168 (2010).
- Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. I., Davis, C. E. Killing of Aspergillus spores depends on the anatomical source of the macrophage. Infect Immun. 42, 1109-1115 (1983).
- Goodridge, H. S., et al. Differential use of CARD9 by dectin-1 in macrophages and dendritic cells. J Immunol. 182, 1146-1154 (2009).
