조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPCs) 및 골수 틈새 시장 사이의 상호 작용의 본질은 제대로 이해된다. 맞춤형 하드웨어 변형 및 다단계 획득 프로토콜은 생체 화상 골수 영역 내에 홈 표지 HSPCs 추적 상호 작용과 움직임 이광자 및 공 초점 현미경의 사용을 허용한다.
정지 및 증식, 자기 갱신과 차별화 된 자손의 생산 사이의 미묘한 균형을 통해 조혈 줄기 세포 (조혈 모세포)는 모든 성숙한 혈액 세포 계통의 매출을 유지한다. 특정 HSC 운명에 이르는 복잡한 신호의 조정은 조혈 모세포 아직도 제대로 이해하는 복잡한 골수 미세 환경, [1-2] 사이의 상호 작용에 의존한다.
우리는 다단계 촛점 및 생체 영상 기술의 이광자 안정된 동물 포지셔닝 새롭게 개발 시험편 홀더를 조합함으로써, 높은 해상도 3D HSPCs 함유 스택 및 그 주변 틈새를 수득하고 시간이 지남에 따라이를 모니터링 할 수있다 방법을 설명 멀티 포인트 시간 경과 영상을 통해. 고화질 영상은 검출 생체 표지 조혈 줄기와 조상 세포 (HSPCs)가 골수 내에 거주 할 수 있습니다. 또한, 멀티 포인트 시간 경과 3D 이미징, 오빠른 취득 설정 btained, HSPC 운동과 HSPCs 간질 세포 사이의 상호 작용에 대한 정확한 정보를 제공합니다.
GFP 긍정적 인 조골 세포 관련 HSPCs의 추적이 방법의 예시적인 응용 프로그램으로 표시됩니다. 이 기술은 두 개관 마우스 골수 공간 내에서 관심있는 적절히 표지 된 기질 또는 조혈 세포를 추적하는 데 이용 될 수있다.
줄기 세포 틈새는 후각 망울, 근육 섬유, 모낭 돌출 또는 CNS 뇌실 영역 4-7로 수십 세를 인정하고 잘 많은 조직에서 특징졌습니다에도 불구하고, 조혈 줄기 세포 (조혈 모세포) 및 골수 미세 환경 사이의 상호 작용 ( BM)은 여전히 좋지 의한 직접 뼈를 통해 단일 세포뿐만 아니라 조직 자체의 유체 극히 자연 관찰의 어려움으로 이해된다. 이는 다른 세포 유형 및 규제 신호의 복잡한 네트워크가 정지 사이의 정교한 균형을 조절하는 책임이 있는지, 절제 또는 조혈 모세포 또는 미세 자체의 간질 세포 중 특정 유전자를 과발현에 기초한 기능적 많은 연구를 통해 밝혀졌다 , 증식, 확장 및 조혈 모세포 1-2의 차별화. 조혈 모세포와 그 틈새 사이의 크로스 토크는 직접 관찰을 통해 깊이 이해 될 수있다. 이 ACH입니다뿐만 현미경의 관점에서 가능한 기술을 조합 한 고급 이미징 프로토콜 개발 ievable 덕분뿐만 아니라 시편 홀더 솔루션 및 수집 소프트웨어.
마우스의 두개골 뼈의 BM 실에서 이식 된 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPCs)의 단일 셀 해상도 라이브 영상은 engrafting의 HSPCs 더 미성숙 세포 SDF-1, VCAM-1 양성 혈관 8-9의 근접 것을 지역화 것으로 나타났다 자신의 자손이 10보다 원위부 동안 GFP 양성 골아 세포 (조골 세포 제한 콜라겐 1α 프로모터는 GFP 발현을 구동하는 Col2.3-GFP 유전자 변형 마우스 라인)에서 20 미크론 – 15 내에서 발견된다. 유사 관찰 해부 및 뼈 골절 된 대퇴골 (11)로부터와 박형화 tibeal 뼈 (12)로부터 수득 하였다. 개관 골수 내 이미징 번째 HSPCs 직접적인 시각화를 달성하기 위해 최소 침습 접근 남아EIR 기본 미세.
모든 살아있는 검체 이미징 인해 샘플 불필요한 움직임 아티팩트를 회피 할 수만큼 샘플을 여전히 유지하는 고유의 필요성이 존재한다. 호흡 개관 골수 촬상시 회피해야 마우스 헤드의 진동 운동을시킨다. 그들은 정면 뼈를 방해하기 때문에 뇌 영상 및 전기 생리학에 대한 예를 들어 사용되는 기존의 정위 홀더, 두 개관 영상에 적합하지 않습니다. 라이브 영상과 전기 생리학 연구 13시 고통을 최소화 할 마우스 홀더부터는 두 성분 홀더와 고정하거나 보장 큰 아암에 연결된 촬상 윈도우를 생성하는 마우스의 머리에 고정 작은 조각으로, 개발 현미경 단계에 단단히 고정 무거운베이스 플레이트. 여전히 제자리에 헤드를 고정화하고 적절 m을 제거하면서 마우스 두개골에 머리 부재를 고정하는 자유를 허용 호흡호흡에 의한 ovements. 홀더 본체에 헤드 부분을 연결하는 A '로크 및 키'기구는 윈도우의 크기가되므로 수술을 간소화, 측위 정밀도가 향상뿐만 아니라 최소로 할 수 있도록하고, 스테이지에베이스 플레이트의 착용감 현미경에 대한 정확한 정렬 할 수 있습니다. 세포 운동성을 정확하게 모니터링하기 위해, 멀티 – 포인트 시간 경과 프로토콜은 시점 간 5 분 간격으로 시간이 지남에 따라 세포의 추적을 할 수 있도록 설계되었다. 여기에, 표시 DID 조혈 모세포는 col2.3GFP의 osteoblasitc 기자 마우스 10, 14에 주입 약 20 시간 후 몇 군데 있습니다. 디자인 된 여러 시간에 걸쳐 동일한 부분을 신속 다점 경과 이미징을 수행하는데 필요한 촬상 설정을 상세하게 설명한다 마우스 홀더.
무엇을 성취했다?
프로토콜은 마우스 두개골 골수 정제하여 FACS의 이주, 생체 표지, 이식 HSPCs을 모니터링 경과 다차원 이미징을 사용한다. 하나의 이식 세포의 확인이 달성되었고, 이러한 고정밀 시간 (시간)의 장기간에 걸쳐 모니터링 하였다. 호흡에 의한 움직임 아티팩트는 최소화하고 세포를 반복적으로 오랜 시간에 걸쳐 이미지를 다시하고있다.
향후 방향은 무엇입니까?
기술의 발전은 단축과 주 (마우스에 대해 복구 프로세스를 단순화하기 위해 주 이상 및 이소 플루 란과 같은 가스 마취제의 사용 과정을 통해, 여러 날 촬상 있도록 회복 실험 진전 수 : 회복 실험이 엄격하게 필요 무균 수술 조건으로 적절한 진통제의 투여). 데브생체 염료의 큰 컬러 팔레트뿐만 아니라, 또한, 멀티 – 표지 실험을 용이 골수 내의 세포 – 세포 상호 작용에 대한 추가 통찰력을 제공하고, 미래에 더욱 복잡한 실험 허용 조혈 세포의 효율적인 유전자 표지의 elopment. 또한, 다수의 골수 구조 및 기질 성분의 동시 라벨링 HSPC 틈새에서 발생하는 이벤트의보다 완전한 화상을 제공 할 것이다. 시간 경과 영화 이미지 안정성은 현미경을 안정화뿐만 아니라, 상기 이미지 정렬 알고리즘을 사용하여 샘플과 postacquisition에서 온도 구배를 최소화함으로써 preacquisition을 향상시킬 수있다.
제한 사항 :
설명이 기술은 몇 가지 제한 사항을 제시한다. 주 사용 마취제의 투여 후 쥐의 생존은 예측 불가능하며 개별 응답에 따라 경험 합병증에 매우 쉽습니다마취. 마우스를 마취로부터 회복하고 마우스 이상적 시간 경과 영상의 재생 시간을 제한하는, 복구 할 경우주의 깊게 계획하는 것이 중요하다 위해 일반적으로 촬상 세션 이상 어렵게이다. 주 사용 마취제의 사용은 각 이미징 세션이 지속될 수있는 시간을 제한한다. 이 마취제의 작은 투여하여 마취 readministering을 연장하는 것이 가능하지만, 그것은 어려운이 정확하고 마우스를 과잉 투여하는 것은 생체 내 이미징의 조기 종료의 가장 흔한 원인 중 하나로 수행된다. 이소 플루 란의> 2 시간 오랫동안 관리가 거의 성공 후 가스 마취 마우스 그러나 빠른 회복, 적은 독성이 더 긴 초기 이미징 세션 수 있습니다. 또 다른 기술의 한계로 인해 급속하게 이미지를 수집 할 필요성으로, 다점 경과 촬상 동안 얻을 수있다 화상의 해상도가 제한된다. 초점 드리프트 또는 필드 결합이, (디스크 점프) 위 ussed, 세포의 추적을 어렵게 만들 수 있습니다.
다른 방법과의 비교 :
HSPCs는 일반적했던 친 유성 염료로 표시되어 있지만, [16]에서 검토로 DIR 및 DII 염료는, 대신 할 수있는 대체 및 다른 세포 염료만큼 충분히 밝은 사용할 수 있습니다. 세포의 체외로 라벨링이 조혈 모세포의 장기 기능에 영향을주지 밝혀졌다 않았지만, 그것은 세포 분열에 희석 DID 제한 (또는 다른 화학적 염색)를 갖는다. 조혈 모세포 이식 후 처음 일 동안 증식 때문에, 이러한 셀들에 대한 신호 대 잡음비가 급격히 저하된다. 유전자 조작 및 형광 단백질의 발현에 의해 세포의 내생 라벨링 형광 단백질 두개골 뼈를 통해 검출 신호를 생성하기에 충분히 높은 수준으로 발현되는만큼, 대안 방법이다. 대안 TECHN에는 여러 가지가 있습니다사용할 iques 자신 장점과 한계, 골수 공간 내 각 HSPCs의 촬상을 수행한다. 공 촛점 이미지는 외과 드릴 경골 뼈 에나멜 얇아 수술 노출을 따르면서 광섬유 기반 이미징 장치의 삽입은, 긴 뼈 [8]에서 골수 재구성의 촬상 허용 [12] HSPCs가 거주의 상세한 이미지를 생성 긴 뼈의 주연 영역. 그러나 이러한 방법은 훨씬 더 침습적 여기서 설명과 동일하므로 마우스 내의 동일 골수 영역에 초점을 촬상 세션을 반복하도록 허용하지 않는 한보다. 또한, 이들 기술은 주변 조직에 큰 손상을 피할 응답 주어진 관찰 세포에 영향을 미칠 수 있다는 것이 가능하다. HSPCs은 절제, 골절 된 대퇴골 [11] 위에 배치 된 커버를 통해 짧은 시간 동안 묘화되어, HSPCs에 조직이 거칠고 준비하지만 영향 클레아 아니다R 및 기술은 하나의 시점에 관찰을 얻기 위해 고유 사용 하였다. 고정 뼈 염색, 직렬 섹션으로 절단하고, 얻어진 화상이 혈관 캐스트가 사용되는 특히 우수한 3D 해상도를 제공하는, 3 차원 모델로 재구성되었다 [17], 최근에는 레이저 스캐닝 세포 계측법 (LASC) 정량적 얻기 위해 사용되었다 현장에서 HSPCs에 대한 조치는 [18] 면역 염색에 의해 강조하지만, 세포의 행동에 대한 시간 정보를 제공 할 수 없습니다. 이 새로운 기술에 설명 된 기술들은 4d에 셀을 모니터링하는 차원에서 양호한 해상도, 충분한 시간적 샘플링의 조합을 제공하고 따라서 골수와 상호 작용 HSPCs 장기간 모니터링을 달성하기 위해 적합한 방법을 제공하고, 상대적으로 비 침습 미시.
The authors have nothing to disclose.
영상은 박사 마틴 Spitaler에 의해 관리 임페리얼 칼리지 런던 (Imperial College London)의 FILM 시설 내에있는 수직 라이카 SP5 공 초점 현미경을 실시 하였다.
시편 홀더와 헤드 피스는 사무엘 존스 박사 사이먼 슐츠의 조언과 임페리얼 칼리지 런던 (Imperial College London)의 화학 공학과와 공동으로 이루어졌다.
니콜라 Ruivo, 시스코 디아즈와 임페리얼 칼리지에서 CBS 직원은 마우스 사육에 자신의 지원과 조언을 쓸모 있었다. 마크 스콧 CRUK, KKLF, BBSRC 및 HFSP에 의해 CRUK와 크리스티나 소호되었습니다 Celso에 의해 HFSP 및 FILM, Olufolake Akinduro에 의해 투자된다.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Ketamine(Narketan 100mg/ml) | Vetoquinol | 407575 0107 C | Other anesthetics may be used in place of this. |
Medetomidine(Domitor 1mg/ml) | Elanco | 134800-2 | Other analgesics may b used in place of this. |
Vibrant DiD cell labeling solution | Roche Products Ltd. | V22887 | Other colors are available and may be used if required. |
Lacrilube ophtalmic ointment | Allergan | n/a | avaliable by prescription by the local vet |
Kemdent "Diamond Carve" glass ionomer cement | Associated Dental Products Ltd. via Kemdent | SUN527 | We use shade A3, but any shade of cement can be used. |
PBS | multiple equivalent | n/a | |
Sterile water | multiple equivalent | n/a | |
Insulin syringes | Terumo Medical Corporation | SS10M3109 | 1mL, 31G |
Mouse restrainer | Harvard Apparatus | 340031 | Cone type (small) |
Autoclaved forceps and scissors | Agar Scientific | AGT577 AGT5034 |
Iris scissors – 90mm; Dumont HP tweezers (0.06mm tip) |
Weigh boat and cement stirrer | VWR | 611-1996/231-0370 | 5mL weigh-boat (black)/ Wooden tongue depressor |
Leica SP5 upright confocal microscope with motorized stage and two-photon laser | Leica Microsystems | Not available | Call for quote |
25x water dipping objective lens (N.A. = 0.95) | Leica Microsystems | 11506323 | HCX IRAPO L lens |
Custom designed mouse holder | Imperial College Engineering Workshop | N/A | See Figure 1 for details |
Heating pad with rectal thermometer probe | BASi Instrumentation | FHC-40902/ FHC-40908/ FHC-4090502 | Heat mat/ Control box/ Thermometer probe |