造血幹細胞および前駆細胞(HSPCs)および骨髄ニッチの間の相互作用の性質は、ほとんど理解されている。カスタムハードウェアの修正および多段階取得プロトコルは、ex vivo画像骨髄エリア内ホーミング標識HSPCs、追跡相互作用及び運動に二光子共焦点顕微鏡の使用を可能にする。
静止状態と増殖、自己再生と分化した子孫の生成との間の微妙なバランスにより、造血幹細胞(HSC)は、すべての成熟血液細胞系統の売上高を維持している。特定のHSCの運命につながる複雑な信号の調整は、HSCおよびまだ十分に理解されていない複雑な骨髄微小環境、[1-2]の間の相互作用に依存している。
私たちは、多段階の共焦点およびin vivoイメージング技術における二光子との安定した動物の位置決めのために新たに開発された試料ホルダを組み合わせることにより、高解像度の3D HSPCsを含むスタックとその周囲のニッチを取得し、時間をかけてそれらを監視することができる方法について説明多点タイムラプスイメージングを通して。高精細イメージングは、ex vivoでの検出を可能に骨髄内にある造血幹細胞および前駆細胞(HSPCs)を標識した。また、多点タイムラプス3Dイメージング、Oより速く取得設定でbtained、HSPCの動きとHSPCsと間質細胞との間の相互の相互作用に関する正確な情報を提供しています。
GFP陽性骨芽細胞に対するHSPCsの追跡は、この方法の応用例として示されている。この技術は、マウス頭蓋冠、骨髄空間内の関心のある任意の適切に標識された造血または間質細胞を追跡するために利用することができる。
幹細胞ニッチは、嗅球、筋線維、毛包バルジまたはCNS脳室下帯4-7として何十年3について認識し、多くの組織において特徴付けされたにもかかわらず、造血幹細胞(HSC)と骨髄微小環境との間の相互作用( BM)はまだ不十分による直接骨を通る単一の細胞ならびに組織自体の非常に流動性を観察するのが困難に理解されている。これは、異なる細胞型および調節シグナルの複雑なネットワークが休止の間に微妙なバランスの調節に関与することを、アブレーションまたはHSCまたはその微小環境自体の間質細胞のいずれかにおける特定の遺伝子を過剰発現に基づく機能多数の研究を通して、示されたHSCは1-2の、増殖、拡大および分化。 HSCおよびそれらのニッチの間のクロストークは、直接観察を通して深く理解することができる。これはACHですのみならず、顕微鏡の観点で利用可能な技術を組み合わせた高度な画像処理プロトコルの開発にievableおかげで、だけでなく、試料ホルダソリューションと取得ソフトウェアの。
マウス頭蓋冠の骨の骨髄コンパートメント内移植した造血幹細胞および前駆細胞(HSPCs)の単一細胞の解像度のライブイメージングは、移植するHSPCsは、SDF-1およびVCAM-1陽性血管8-9とそのより未熟細胞の近傍に局在することが示された彼らの子孫は10より遠位であるがGFP陽性骨芽細胞(骨芽制限コラーゲン1αプロモーターは、GFPの発現を駆動するCol2.3-GFPトランスジェニックマウス系統)から20ミクロン- 15内に発見された。同様の観察を切開し、骨折した大腿骨11及び薄くtibeal骨12から得られた。頭蓋冠骨髄のイメージングは、目の中HSPCsの直接可視化を実現するために最も侵襲アプローチのままEIRネイティブ微小環境。
任意の生標本撮像に起因する試料の移動に不要なアーチファクトを回避することができる限り、サンプルを保持する固有の必要性がある。呼吸は、頭蓋冠、骨髄を撮像する場合に回避する必要があるマウスヘッドの振動運動を引き起こす。彼らは前頭骨を妨げているため、脳のイメージングと電気生理学のために、例えば使用される従来の定位保有者は、頭蓋冠イメージングには適していません。ライブイメージングと電気生理学的研究の13時の苦痛を最小化するために使用したマウスホルダーから出発し、2部品ホルダとの安定したホールド性を確保する大きなアームに接続されたイメージング·ウィンドウを作成するには、マウスの頭部に固定された小片で、開発されました顕微鏡ステージにしっかりと固定している重いベースプレート。まだ所定の位置にヘッドを固定し、十分メートルを排除し、マウスの頭蓋骨にヘッドピースの確保が無料で呼吸を可能にする呼吸によるovements。ホルダ本体にヘッドピースを連結する「鍵と鍵穴」メカニズムは、したがって、手術が簡素化ウィンドウのサイズが最小化ならびに位置決め精度を向上させることができるため、ステージにベースプレートのフィット顕微鏡での正確な位置合わせが可能になります。正確な運動性細胞をモニターするために、多点タイムラプスプロトコル時点間5分間隔で経時的に細胞の追跡を可能にするように設計された。ここでは、ラベルされたDID HSCはcol2.3GFPのosteoblasitcレポーターマウス10,14に注入し、約20時間後に撮像される。設計された、複数の時間の期間にわたって同じ分野の急速な多点タイムラプス撮影を実行するために必要なイメージング設定は詳細に記載されているマウスホルダー。
何が達成された?
プロトコルは、精製されたFACSの移動を監視するために、マウス頭蓋冠骨髄におけるex vivoで標識された、移植されたHSPCsをタイムラプス多次元イメージングを使用しています。単一の移植された細胞の同定が達成されており、これらは高精度に時間(hr)を長期間にわたって監視されている。呼吸誘発性運動アーチファクトが最小化され、細胞が繰り返し延長された時間経過にわたって再イメージされています。
今後の方向性は何ですか?
技術の開発を短縮し、注意してください(マウス用リカバリプロセスを簡素化するために一週間以上かかるイソフルランなどのガス麻酔薬の使用の過程で、複数の日に撮影を可能にするために、回収実験に向けて進行できます。回収実験は、厳密に必要と無菌手術条件および適切な鎮痛薬の投与)。開発in vivoでの染料の大きなカラーパレットだけでなく、また、多標識実験を容易に骨髄内の細胞間相互作用により多くの洞察を提供し、将来的にはより複雑な実験を可能にする、造血細胞の効率的な遺伝標識elopment。さらに、複数の骨髄構造および間質成分の同時標識はHSPCニッチで起こるイベントのより完全な像を提供する。タイムラプスムービーの画像安定性は、さらに、顕微鏡の安定化、ならびに画像レジストレーションアルゴリズムを用いて試料とpostacquisitionに温度勾配を最小化することによって買収前を向上させることができた。
制限事項 :
記載されている技術には、いくつかの制限を提示します。注射用麻酔薬の投与後のマウスの生存率は予測不可能であり、それはに対する個体の応答に応じて合併症を経験することは非常に容易である麻酔薬。マウスを麻酔から回復するために一般的に、撮像セッション長く、困難であり、それは、マウスは、理想的には、タイムラプス撮影の継続時間を制限する、回収される場合に慎重に計画することが重要である。注射用麻酔薬の使用は、各撮像セッションが続くことができる時間を制限する。それは麻酔薬のより少ない用量を再投与することによって麻酔を延長することが可能であるが、それは困難であり、正確かつマウスを過剰投与、これを実行するin vivoイメージングの早期終了の最も頻繁な原因の一つである。イソフルランの> 2時間長い投与はめったに成功した後のガス麻酔は、マウスのしかし急速な回復、低毒性で、より長い初期撮像セッションが可能になります。技術の別の制限は、迅速に画像を取得する必要性、多点タイムラプス撮影中に得られる画像の解像度が限られている。焦点ドリフトやフィールドと相まってこれは、(ディスクをジャンプ上記ussed)、細胞の追跡を困難にすることができます。
代替的な方法と比較:
HSPCsは通常DID親油性色素で標識されているが、[16]で検討としてDIRとのDiI色素には、同等の代替及び他の細胞色素は限り、十分に明るい使用することができます。 DIDの細胞のex vivoで標識化HSCの長期的な機能に影響を与えないことが示されているにもかかわらず、それがDID制限(または任意の他の化学色素)を有し、細胞分裂の際に希釈される。 HSCは、移植後最初の日の間に増殖しているので、これらの細胞のための信号対雑音比が急激に劣化する。遺伝子操作蛍光タンパク質の発現による細胞の内因性標識は、蛍光タンパク質は、頭蓋骨を通して検出可能なシグナルを生成するために十分に高いレベルで発現される限り、実行可能な代替法である。代替?と思ったらがいくつかあります骨髄空間内HSPCsの撮影を行うために利用可能iques、独自の利点と限界を持つ各。共焦点画像は、外科手術用ドリルで骨エナメルの脛骨および薄化の外科的露出に追従して、[8]長骨における骨髄再構成のイメージングのために許可された光ファイバベースのイメージングデバイスを挿入する[12]内に存在するHSPCsの詳細な画像を生成し長骨の周辺領域。しかしこれらの方法は、はるかに侵襲ここで説明するので、同じマウス内の同じ骨髄エリアに焦点を当てたイメージングセッションを繰り返すことが許可されていないものよりもある。また、これらの技術は、周囲の組織に豊富な損傷に応答不可避与えられた観察細胞に影響を及ぼす可能性がある。 HSPCsしかしHSPCs上の組織のこの過酷な準備の影響はクレアではないが、[11]切除した、骨折した大腿骨の上に配置されたカバースリップを通して短期間に結像されていますrおよび技術は、単一時点の観測を得るために一意的に使用された。固定された骨は染色され、連続切片に区分し、得られた画像は、血管のキャストを使用する特に優れた3次元分解能を提供する、3Dモデルに再構築された[17]は 、最近レーザー走査サイトメトリー(LASC)定量得るために使用されている免疫染色によって強調され、その場で HSPCs約措置、[18]が、細胞の挙動についての時間的情報を提供することはできません。したがって、骨髄と相互作用HSPCsの長期モニタリングを達成するために理想的なアプローチを提供し、この新たな技術に記載された技術は、4Dで細胞を監視するために、3D、十分な時間的サンプリングで良好な解像度との組み合わせを提供し、それらは比較的非侵襲的である微小環境。
The authors have nothing to disclose.
イメージングは、博士マーティンSpitalerによって管理インペリアル·カレッジ·ロンドンの膜施設内に位置直立ライカSP5共焦点顕微鏡上で実施した。
試料ホルダーおよびヘッドピースはサミュエル·ジョーンズ博士とサイモン·シュルツからの助言で、インペリアル·カレッジ·ロンドンの化学工学部門と共同で行われました。
ニコラRuivo、フランシスコ·ディアスとインペリアル·カレッジでのCBSのスタッフは、マウスの飼育上の支援や助言のため尽力した。 マーク·スコットはCRUK、KKLF、BBSRCとHFSPによってCRUKとクリスティーナ·ローセルソによりHFSPや映画、Olufolake Akinduroによって資金を供給されている。
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Ketamine(Narketan 100mg/ml) | Vetoquinol | 407575 0107 C | Other anesthetics may be used in place of this. |
Medetomidine(Domitor 1mg/ml) | Elanco | 134800-2 | Other analgesics may b used in place of this. |
Vibrant DiD cell labeling solution | Roche Products Ltd. | V22887 | Other colors are available and may be used if required. |
Lacrilube ophtalmic ointment | Allergan | n/a | avaliable by prescription by the local vet |
Kemdent "Diamond Carve" glass ionomer cement | Associated Dental Products Ltd. via Kemdent | SUN527 | We use shade A3, but any shade of cement can be used. |
PBS | multiple equivalent | n/a | |
Sterile water | multiple equivalent | n/a | |
Insulin syringes | Terumo Medical Corporation | SS10M3109 | 1mL, 31G |
Mouse restrainer | Harvard Apparatus | 340031 | Cone type (small) |
Autoclaved forceps and scissors | Agar Scientific | AGT577 AGT5034 |
Iris scissors – 90mm; Dumont HP tweezers (0.06mm tip) |
Weigh boat and cement stirrer | VWR | 611-1996/231-0370 | 5mL weigh-boat (black)/ Wooden tongue depressor |
Leica SP5 upright confocal microscope with motorized stage and two-photon laser | Leica Microsystems | Not available | Call for quote |
25x water dipping objective lens (N.A. = 0.95) | Leica Microsystems | 11506323 | HCX IRAPO L lens |
Custom designed mouse holder | Imperial College Engineering Workshop | N/A | See Figure 1 for details |
Heating pad with rectal thermometer probe | BASi Instrumentation | FHC-40902/ FHC-40908/ FHC-4090502 | Heat mat/ Control box/ Thermometer probe |