Electroporator למשלוח סדרתית מולקולרי בסיוע וורטקס microscale
Summary
פלטפורמת electroporation סייע מערבולת microfluidic פותחה למסירה רציפה של מולקולות מרובות לתוך אוכלוסיות תאים זהות עם שליטה מדויקת ובלתי תלויה מינון. electroporation צעד טיהור תא המטרה שקדמו מבוסס גודל של המערכת סייע לשפר את יעילות אספקה מולקולרית וכדאיויות תא מעובד.
Abstract
Electroporation זכתה לתשומת לב הולכת וגובר בשנים האחרונות, כי זה הוא טכניקה חזקה מאוד להחדרה פיזית בדיקות מולקולריות אקסוגני שאינו permeant לתוך תאים. עבודה זו מדווחת פלטפורמת electroporation microfluidic מסוגל לבצע משלוח מולקולה מרובה לתאי יונקים עם שליטה מדויקת ומולקולרית תלויה פרמטר. היכולת של המערכת לבודד את התאים עם התפלגות גודל אחידה מאפשרת פחות וריאציה ביעילות electroporation לעוצמת שדה חשמלית נתון; מכאן משופר כדאיות מדגם. יתר על כן, תכונת ההדמיה תהליך שלה מאפשרת להתבוננות בתהליך הניאון המולקולרי הספיגה בזמן אמת, המאפשר התאמות פרמטר מסירה מולקולריות מהירה באתר לשיפור יעילות. כדי להראות את היכולות עצומות של הפלטפורמה דיווחה, מקרומולקולות עם גדלים שונים ומטענים חשמליים (למשל, Dextran עם MW של 3,000 ו -70,000 Da) היהנמסר לתאי סרטן השד גרורתי עם יעילות גבוהה משלוח (> 70%) עבור כל המולקולות שנבדקו. הפלטפורמה שפותחה הוכיחה את הפוטנציאל שלה לשימוש בהרחבה של תחומי מחקר שבו טכניקות electroporation יכולות להיות על שבב מועילות.
Introduction
בשנים האחרונות, השימוש בפולסים חשמליים כדי להקל על משלוח cytosolic של מולקולות תאיים הפך אמצעי אטרקטיבי של מניפולציה תאי יונקים. 1 תהליך זה, המכונה גם electroporation, הפיך permeabilizes קרום התא, המאפשר למולקולות בלתי חדירים קרום מטבע כדי לקבל גישה לסביבה תאית של התאים. כי כמעט כל מולקולה יכולה להיות מוחדר cytosol באמצעות הנקבוביות שנוצרו זמניות בקרום של כל סוג של תאים באמצעות electroporation, הטכניקה דווחה כיותר לשחזור, ישים באופן אוניוורסלי, ויעיל יותר מאשר שיטות אחרות, כוללים וירוס בתיווך, כימי וגישות אופטיות. 2-3 טכניקה זו נוצלה להציג את מולקולות ניאון, 4 תרופות 5 וחומצות גרעין 6-7, תוך שמירה על תאי קיימא ושלמים. בהתחשב ביתרונות הללו, electroporation אומצה כעבודה משותפתטכניקת atory לtransfection DNA, in vivo ריפוי גנטי 8 ומחקרי חיסון תא. היא, לעומת זאת, עדיין קשה למערכות electroporation קונבנציונליות כדי להשיג בו זמנית יעילות מעשית ויכולת קיום לדגימות עם הטרוגניות גדולה בגודלם ועוצמת השדה החשמלי הנדרשת לelectroporation המוצלח בקורלציה הדוקה עם הקוטר של התא. יתר על כן, מערכות אלה אינן מאפשרים שליטה מדויקת של הכמויות מולקולריות מרובות מועברת עקב הסתמכות על תהליך משלוח בתפזורת סטוכסטיים מולקולרי. 9 על מנת לטפל בבעיות אלה, קבוצות רבות פיתחו פלטפורמות electroporation microfluidic, המציעות את היתרון של מתחי poration נמוכים יותר, יעילות טובה יותר transfection, ירידה גדולה בתמותת תאים, והיכולת לספק מולקולות מרובות. 10-13 יתרונות אלה התאפשרו הודות לטביעות הרגליים הקטנות של מערכות electroporation microscale אלקטרודה שהמגרשאורכים הם תת מילימטרים, באופן דרמטי ירידת מתח הנדרש למשלוח מוצלח. יתר על כן, מערכות electroporation microscale אלה יכולים להשיג הפצת שדה חשמלית אחידה ובמהירות לפזר חום שנוצר, מניב תמותת תא מופחת תוך שיפור יעילות משלוח. הניצול של חומרים שקופים לשבבים אלה נוספים מאפשר בתצפית באתרו של תהליך electroporation לשינויים פרמטר הפקודה. 2,12 עם זאת, שליטה במינון מדויקת ושליטה פרמטר מולקולרית ותאית תלויה, הנדרשת למחקר חדש ויישומים טיפוליים, 6, 14-16 עדיין נותר לא פתור.
עבודה זו מציגה מערכת microfluidic בסיוע מערבולת electroporation, מסוגל לספק מולקולות מרובות ברצף לאוכלוסייה זהה שנבחר מראש של תאי מטרה. תאים עם התפלגות גודל האחיד מבודדים לפני electroporation באמצעות si שדווח בעברמנגנון ze סלקטיבי השמנה. 17-18 על ידי בעל התפלגות אחידה בגודל, פחות וריאציה ביעילות electroporation וכדאיות משופרת לעוצמת שדה חשמלית נתון הושגו. 19 יתר על כן, ברציפות התססה תאים לכודים באמצעות מערבולות microscale אפשר למסירה אחידה של מולקולות על פני cytosol כל, בהסכם עם התוצאות שדווחה בעבר באמצעות פלטפורמה אחרת electroporation בסיוע מערבולת. 20 כדי להוכיח כי מערכת זו תהיה ישימה למגוון רחב של המולקולות בשימוש הנרחבים ביישומים ביולוגיים, מקרומולקולות עם מגוון רחב של משקלים מולקולריים הועברו ל תאי סרטן השד גרורתי. בנוסף, בעזרת ניטור תהליך בזמן אמת, עבודה זו מספקת ראיות נוספות כדי לשים קץ לוויכוח הארוך הימים בנוגע למנגנון של משלוח מולקולרי לבמהלך electrporation, מכיוון שרוב תושבי אלקטרופורזה בתיווך מול בתיווך דיפוזיה. 14 </sup> בניגוד למערכות electroporation אחרים, פלטפורמה ייחודית זה מספקת יתרונות בשילוב של מסירה מדויקת מרובה מולקולה, יעילות אספקה מולקולרית גבוהה, תמותת תאים מינימאלית, תוחלת רחבה של גודל וחיובים של מולקולות נמסרו, כמו גם להדמיה בזמן אמת של electroporation תהליך. בהתחשב ביכולות אלה, מערכת electroporation פיתחה יש פוטנציאל מעשי ככלי תכליתי ללימודי תכנות מחדש של תאים, אספקת יישומי 6,14,21-22 תרופה 10,19 ויישומים הדורשים להבנה מעמיקה של מנגנוני אספקה מולקולריים electroporation.
Protocol
Representative Results
Discussion
עם הפלטפורמה החדשה parallelized electroporation, השיפור של פי 10 בתפוקה ויעילות של משלוח מרובה מולקולה הושגה, בנוסף לכל היתרונות שהמערכת אחת קאמרית שפותחה בעבר מספקת. 18 יתרונות זמינים בעבר כוללים (i) לפני טיהור יעד תאים עם התפלגות אחידה גודל לשיפור כדאיות, (ii) שליטת מינון מולקו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי תכנית רולנד Junior העמית. המחברים מבקשים להביע את תודה למדענים ואנשי צוות במכון רולנד בהרווארד: כריס סטוקס על עזרתו בפיתוח, ההתקנה שהותקן בסיוע מחשב בקרת לחץ, דיאן Schaak, Ph.D. עבור קלטה לטיפול מדגם ביולוגי, וינפילד היל לפיתוח ההתקנה החשמלית, Alavaro סאנצ'ז, Ph.D. למתן גישה לזרימת cytometer, סקוט בוויס, קני ספנסר ודון רוג'רס לעיבוד רכיבי צנרת מכאניים הנדרשים להתקנת הלחץ. אדוני microfluidic היו מפוברקים במרכז למערכות ננו (CNS) באוניברסיטת הרווארד.
Materials
| MDA-MB-231 cancer cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-26 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Cellgro, Mediatech, Inc. | 10-045-CV | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Life Technologies | 16000-044 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Cellgro, Mediatech, Inc. | 21-030 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 25200-056 | |
| Flow Cytometer easyCyte HT | Millipore | 0500-4008 | |
| Oxygen Plasma Cleaner | Technics Micro-RIE | ||
| Dektak 6M surface profiler | Veeco | ||
| KMPR 1050 | Microchem | ||
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning | ||
| Compressed Nitrogen gas | Airgas | NI 300 | |
| High Pressure Regulator | McMaster-Carr | 6162K22 | |
| Downstream regulator | McMaster-Carr | 4000K563 | |
| high-speed 3/2way-8 valve manifold | Festo | ||
| Inline Check Valve | Idex Health and Science | CV3320 | |
| 5/32" OD x 3/32"ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-156F-0 | |
| 1/4" OD X 0.17" ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-250PB-4 | |
| 1/16" PEEK tubings | Festo | P1533 | |
| 1/32" PEEK tubings | Idex Health and Science | P1569 | |
| PEEK tubing unions | Idex Health and Science | P881 | |
| Pulse Generator | HP | 8110A | |
| Aluiminum Wire | Bob Martin Company | 6061 ALUM | |
| oscilloscope | Agilent | DSO3062A | |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 21008-178 | |
| 15 mL centrifuge tube | VWR | 21008-216 | |
| T75 culture flask | VWR | 82050-862 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 3000 MW, Anionic | Gibco, Life Technologies | D3307 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 70,000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D1819 | |
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D3329 |
References
- Nakamura, H., Funahashi, J. Electroporation Past present and future. Dev Growth Diff. 55, 15-19 (2013).
- Geng, T., Lu, C. Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery. Lab Chip. 13, 3803-3821 (2013).
- Shahini, M., van Wijngaarden, F., Yeow, J. T. W. Fabrication of electro-microfluidic channel for single cell electroporation. Biomedical Microdevices. 15, 759-766 (2013).
- Neumann, E., Toensing, K., Kakorin, S., Budde, P., Frey, J. Mechanism of electroporative dye uptake by mouse B cells. Biophysical Journal. 74, 98-108 (1998).
- Jaroszeski, M. J., et al. Toxicity of anticancer agents mediated by electroporation in vitro. Anti-Cancer Drugs. 11, 201-208 (2000).
- Buntru, M., Gartner, S., Staib, L., Kreuzaler, F., Schlaich, N. Delivery of multiple transgenes to plant cells by an improved version of MultiRound Gateway technology. Transgenic Res. 22, 153-167 (2013).
- Mir, L. M., et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4262-4267 (1999).
- Heller, R., et al. Intradermal delivery of interleukin-12 plasmid DNA by in vivo electroporation. DNA Cell Biol. 20, 381-381 (2001).
- Boukany, P. E., et al. Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells. Nat Nanotechnol. 6, 747-754 (2011).
- Wang, J., et al. Synergistic Effects of Nanosecond Pulsed Electric Fields Combined with Low Concentration of Gemcitabine on Human Oral Squamous Cell Carcinoma. In Vitro PLoS One. 7, (2012).
- Kim, M. J., Kim, T., Cho, Y. H. Cell electroporation chip using multiple electric field zones in a single channel. Appl Phys Lett. 101, (2012).
- Wang, S. N., Lee, L. J. Micro-/nanofluidics based cell electroporation. Biomicrofluidics. 7, (2013).
- Sharei, A., et al. A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery. Proc. Natl Acad Sci USA. 110, 2082-2087 (2013).
- Kim, J. B., et al. Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4. Nature. 461, U649-U693 (2009).
- Ozbas-Turan, S., Aral, C., Kabasakal, L., Keyer-Uysal, M., Akbuga, J. Co-encapsulation of two plasmids in chitosan microspheres as a non-viral gene delivery vehicle. J Pharm Pharm Sci. 6, 27-32 (2003).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, U311-U313 (2007).
- Hur, S. C., Mach, A. J., Di Carlo, D. High-throughput size-based rare cell enrichment using microscale vortices. Biomicrofluidics. 5, (2011).
- Yun, H. Y., Hur, S. C. Sequential multi-molecule delivery using vortex-assisted electroporation. Lab Chip. 13, 2764-2772 (2013).
- Gehl, J. Electroporation theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiol Scand. 177, 437-447 (2003).
- Wang, J., Zhan, Y. H., Ugaz, V. M., Lu, C. Vortex-assisted DNA delivery. Lab Chip. 10, 2057-2061 (2010).
- Jia, F. J., et al. A nonviral minicircle vector for deriving human iPS cells. Nature Methods. 7, U146-U197 (2010).
- Dunbar, C. E. Gene transfer to hematopoietic stem cells Implications for gene therapy of human disease. Annual Review of Medicine. 47, 11-20 (1996).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angew Chem-Int Edit. 37, 551-575 (1998).
- Graziadei, L., Burfeind, P., Barsagi, D. Introduction of Unlabeled Proteins into Living Cells by Electroporation and Isolation of Viable Protein-Loaded Cells Using Dextran Fluorescein Isothiocyanate as a Marker for Protein-Uptake. Anal Biochem. 194, 198-203 (1991).
- Dimitrov, D. S., Sowers, A. E. Membrane Electroporation-Fast Molecular-Exchange by Electroosmosis. Biochimica Et Biophysica Acta. 1022, 381-392 (1990).
- Sukharev, S. I., Klenchin, V. A., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev Yu, A. Electroporation and electrophoretic DNA transfer into cells. The effect of DNA interaction with electropores. Biophysical Journal. 63, 1320-1327 (1992).
- Glogauer, M., McCulloch, C. A. G. Introduction of large molecules into viable fibroblasts by electroporation Optimization of loading and identification of labeled cellular compartments. Experimental Cell Research. 200, 227-234 (1992).
- Verspohl, E. J., KaiserlingBuddemeier, I., Wienecke, A. Introducing specific antibodies into electropermeabilized cells is a valuable tool for eliminating specific cell functions. Cell Biochemistry and Function. 15, 127-134 (1997).
