微型涡辅助电穿孔的顺序传递分子
Summary
微流体涡辅助电平台的连续交付的多个分子进入相同的细胞群与精确，独立的剂量控制开发。该系统的大小基于靶细胞纯化步骤前电穿孔辅助以增强分子递送效率和处理的细胞活力。
Abstract
电越来越受到重视，在过去几年中，因为它是一个非常强大的技术引入物理不可穿透物外源性分子探针进入细胞。这项工作汇报微流体电平台，能够执行多种分子运送到哺乳动物细胞具有精确和分子有关的参数控制。该系统的分离的细胞具有均匀尺寸分布的能力允许在每个给定的电场强度电穿孔效率的变化少;因此，提高样品的可行性。此外，它的过程可视化特征允许观察在实时荧光分子的吸收过程，其允许迅速分子递送参数的调整在原位对提高效率的。来显示报告平台的广大的能力，大分子具有不同尺寸和电荷的（ 例如，右旋糖酐具有3000和70000沓MW）为传送到转移性乳腺癌细胞具有高输送效率（> 70％）对所有测试的分子。该开发平台已经证明了自己的潜力，在研究领域，其中片内电穿孔技术是有益的扩展使用。
Introduction
在最近几年，使用电脉冲，以促进胞内递送的细胞外分子已经成为一种有吸引力的操纵哺乳动物细胞的方法。1此过程中，也被称为电穿孔，可逆permeabilizes细胞膜，允许固有膜不可渗透的分子，以获得到细胞的细胞内环境。因为几乎所有的分子可以在任何类型的采用电穿孔的细胞的膜通过临时创建的孔被引入到细胞溶质中，该技术已被报告为更可再现的，普遍适用的，并且比其它的方法包括病毒介导的，化学更高效和光学方法。2-3这一技术已被用来引入荧光分子，4种药物5和核酸6-7，同时保持细胞存活和完整性。考虑到这些好处，电已被批准为一个共同的劳动用于DNA转染atory技术， 体内基因治疗8和细胞疫苗接种研究。它是，但是，仍然难以常规电穿孔系统，可同时实现实用的效率和可行性与大的异质性大小的样品，因为需要成功电穿孔的电场强度密切的细胞的直径相关。此外，这些系统不允许的多个分子的量的精确控制被适当传递到依赖散装随机分子递送过程。9为了解决这些问题，许多组织已经开发微流体电平台，将提供较低的穿孔电压的优点，更好的转染效率，大量减少细胞死亡，并有能力提供多分子。由于微型电系统，其电极间距小脚印10-13这些优点能够成为可能长度为亚毫米，显着减少所需的成功交付电压。此外，这些微型电系统可以实现均匀的电场分布，并迅速消散产生的热量，产生降低细胞死亡率，同时提高配送效率。这些芯片进一步透明材料的运用使得原位观察电过程中的提示参数修改。2,12然而，精确的剂量控制和molecular-和蜂窝相关的参数控制，需要新的研究和治疗应用，6， 14-16仍然没有得到解决。
这项工作提出了一种微流体涡流辅助电穿孔系统，能够提供多种分子依次进入靶细胞的预先选定的相同人口。细胞均匀分布在使用之前报道SI隔离之前，电泽选择性捕获机制。17-18通过具有粒度分布均匀，变化较少的电效率和每个人实现给定的电场强度增强生存能力。19此外，不断搅拌用微型涡被困细胞允许在整个统一发货分子整个细胞质中，与该结果相一致以前报道使用另一个涡旋辅助电平台20为了证明这个系统将适用于范围广泛的生物应用中普遍使用的分子，具有宽范围分子量的大分子递送到转移性乳腺癌细胞。此外，实时过程监控的帮助下，这项工作提供了更多的证据来制止有关的分子传递的机制，长期的辩论中electrporation，主要是电泳介导的抗扩散介导的14 </sup>与其他电穿孔系统，该平台独一无二地提供精确的多分子递送，高分子递送效率，最小的细胞死亡，大小和递送分子的电荷的跨度很广，以及实时可视化的电穿孔的组合优势流程。考虑到这些功能，开发电系统具有实用潜力的多功能工具细胞重编程研究，6,14,21-22给药应用10,19和应用需要进行深入的了解电的分子传递的机制。
Protocol
Representative Results
Discussion
与新的并行电平台，10倍的增强吞吐量和多分子递送效率，除了所有的先前开发的单室型系统提供的优点来实现。18之前提供的优点包括：（i）预净化的靶细胞与活力增强粒度分布均匀，（ⅱ）精确和个别分子的剂量控制，以及（iii）低操作电流。荧光标记的葡聚糖被选择作为感兴趣的分子，因为它们在很宽范围的分子量，缀合的荧光团的类型和电荷的容易获得的。这些大分子都适合这样…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由罗兰初级研究员计划的支持。作者想表达感谢的科学家和工作人员在罗兰研究所是哈佛克里斯·斯托克斯，他的定制，计算机辅助压力控制设置，黛安Schaak博士的帮助下发展她输入的生物样品处理，温菲尔德山开发的电设置，Alavaro桑切斯博士授予访问流式细胞仪，斯科特贝维斯，肯尼斯宾塞和唐·罗杰斯用于加工所需的压力设置机械管道部件。微流控大师是捏造的中心纳米系统（CNS）的哈佛大学。
Materials
| MDA-MB-231 cancer cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-26 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Cellgro, Mediatech, Inc. | 10-045-CV | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Life Technologies | 16000-044 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Cellgro, Mediatech, Inc. | 21-030 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 25200-056 | |
| Flow Cytometer easyCyte HT | Millipore | 0500-4008 | |
| Oxygen Plasma Cleaner | Technics Micro-RIE | ||
| Dektak 6M surface profiler | Veeco | ||
| KMPR 1050 | Microchem | ||
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning | ||
| Compressed Nitrogen gas | Airgas | NI 300 | |
| High Pressure Regulator | McMaster-Carr | 6162K22 | |
| Downstream regulator | McMaster-Carr | 4000K563 | |
| high-speed 3/2way-8 valve manifold | Festo | ||
| Inline Check Valve | Idex Health and Science | CV3320 | |
| 5/32" OD x 3/32"ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-156F-0 | |
| 1/4" OD X 0.17" ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-250PB-4 | |
| 1/16" PEEK tubings | Festo | P1533 | |
| 1/32" PEEK tubings | Idex Health and Science | P1569 | |
| PEEK tubing unions | Idex Health and Science | P881 | |
| Pulse Generator | HP | 8110A | |
| Aluiminum Wire | Bob Martin Company | 6061 ALUM | |
| oscilloscope | Agilent | DSO3062A | |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 21008-178 | |
| 15 mL centrifuge tube | VWR | 21008-216 | |
| T75 culture flask | VWR | 82050-862 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 3000 MW, Anionic | Gibco, Life Technologies | D3307 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 70,000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D1819 | |
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D3329 |
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