Summary

Mikro Vortex-assistert Electroporator for sekvensiell Molecular Levering

Published: August 07, 2014
doi:

Summary

En microfluidic vortex assistert electroporation plattformen ble utviklet for sekvensiell levering av flere molekyler inn i identiske cellepopulasjoner med presis og uavhengig dosering kontroll. Systemets størrelse basert målcellen rensetrinn før elektroporering styrt for å øke molekylleveringseffektiviteten og behandlet celleviabilitet.

Abstract

Electroporation har fått økt oppmerksomhet de siste årene, fordi det er en svært kraftig teknikk for fysisk å innføre ikke-permeant eksogene molekylære prober inn i cellene. Dette arbeidet rapporterer en microfluidic electroporation plattform stand til å utføre flere molekyl levering til pattedyrceller med presis og molekylær avhengig parameter kontroll. Systemets evne til å isolere celler med ensartet størrelsesfordeling tillater mindre variasjon i elektroporering effektivitet per gitt elektrisk feltstyrke; dermed forbedret sample levedyktighet. Videre sin prosess visualisering funksjonen gir mulighet for observasjon av fluorescerende molekyl opptak prosessen i sanntid, som tillater rask molekylære levering parameterjusteringer in situ for effektivisering. For å vise de enorme mulighetene i rapporterte plattform, makromolekyler med forskjellige størrelser og elektriske ladninger (f.eks Dextran med MW 3000 og 70.000 Da) varlevert til metastatisk brystkreft celler med høy leverings effektivitet (> 70%) for alle testede molekyler. Den utviklede plattformen har vist dens potensial for bruk ved ekspansjon av forskningsfelt hvor på-chip electroporation teknikker kan være fordelaktig.

Introduction

De siste årene har bruken av elektriske pulser til rette cytosolic levering av ekstracellulære molekyler blitt et attraktivt midler til å manipulere pattedyrceller. 1 Denne prosessen, også kjent som elektroporering, permeabilizes reversibelt cellemembranen, slik at for iboende membran ugjennomtrengelig molekyler for å få tilgang til cellenes intracellulært miljø. Fordi praktisk talt en hvilken som helst molekyl kan bli introdusert inn i cytosol via midlertidige opprettet porene i membranen av hvilken som helst type av celler ved hjelp av elektroporering, har teknikken blitt rapportert å være mer reproduserbar, universelt anvendelig, og mer effektivt enn andre metoder, inkludert virus-mediert, kjemisk og optiske metoder. 2-3 Denne teknikken har blitt anvendt for å innføre fluorescerende molekyler, 4 5 medikamenter og nukleinsyrer 6-7 samtidig som levedyktige celler og intakt. Gitt disse fordelene, har elektroporering blitt vedtatt som et felles arbeidsmarkedAtory teknikk for DNA-transfeksjon, in vivo genterapi 8 og cellevaksinasjonsstudier. Det er imidlertid fremdeles vanskelig for konvensjonelle electroporation systemer for samtidig å oppnå praktisk effektivitet og levedyktighet for prøver med stor heterogenitet i størrelse fordi den elektriske feltstyrke som kreves for vellykket electroporation tett korrelerer med cellens diameter. Dessuten gjør disse systemene ikke tillater presis kontroll av flere molekylære beløpene blir levert på grunn av avhengighet av bulk stokastisk molekylær leveringsprosessen. 9 For å løse disse problemene, har mange grupper utviklet microfluidic electroporation plattformer, som tilbyr fordelen av lavere poration spenninger, bedre transfeksjon effektivitet, en stor reduksjon i dødelighet celle, og evne til å levere flere molekyler. 10-13 Disse fordelene ble gjort mulig på grunn av de små fotavtrykk av mikro electroporation systemer som elektrode banenlengder er under millimeter, dramatisk redusere spenninger som kreves for vellykket levering. Videre kan disse mikro electroporation systemer oppnå jevn elektrisk feltfordeling og raskt spre generert varme, noe som gir redusert dødelighet cellen og samtidig forbedre leveringseffektiviteten. Utnyttelsen av transparente materialer for disse mikrobrikker videre tillater in situ observasjon av electroporation prosess for rask parameter modifikasjoner. 2,12 imidlertid presis dosering og kontroll molekylær- og celleavhengig parameter styring, som kreves for frem forskning og terapeutiske anvendelser, 6, 14-16 fortsatt forbli uløst.

Dette arbeidet viser et mikrofluid vortex-assistert electroporation system, som kan levere flere molekyler sekvensielt inn i et forhåndsvalgt identisk populasjon av målceller. Celler med enhetlig størrelsesfordeling isoleres før elektroporering ved å bruke tidligere rapportert SIze-selektiv overlapping mekanisme. 17-18 Ved å ha en uniform størrelsesfordeling, mindre variasjon i elektroporering effektivitet og forbedret levedyktigheten per gitt elektrisk feltstyrke ble oppnådd. 19. Videre kontinuerlig omrøring fanget celler ved hjelp av mikro virvlene tillatt for jevn levering av molekyler over hele Hele cytosol, i overensstemmelse med resultatene som tidligere er rapportert ved bruk av en annen virvel-assistert electroporation plattform. 20. For å demonstrere at dette system ville være anvendbar på et bredt utvalg av molekyler som vanligvis benyttes i biologiske anvendelser, makromolekyler med et bredt område av molekylvekter ble levert metastatisk brystkreft celler. I tillegg, ved hjelp av sanntids prosessovervåking, gir dette arbeidet mer bevis for å få en slutt på den langvarige debatten om mekanismen molekylær levering i løpet electrporation, å være overveiende elektroforese-mediert versus diffusjon-mediert. 14 </sup> I motsetning til andre systemer electroporation, denne plattformen gir entydig de kombinerte fordeler ved nøyaktig multi-molekyl levering, høye molekylleveringseffektiviteten, minimal dødelighet celle, et vidt spenn av størrelse og kostnader av levert molekyler, samt sanntids-visualisering av elektroporering prosess. Gitt disse evner, har den utviklet electroporation system praktisk potensial som et allsidig verktøy for cellular omprogrammering studier, 6,14,21-22 stoffet levering applikasjoner 10,19 og applikasjoner som krever for inngående forståelse av electroporation molekylære leveringsmekanismer.

Protocol

1. Cell Forberedelse Plate 1 x 10 5 celler / ml av metastatisk brystkreft-cellelinje MDA-MB-231 i et volum på 10 ml pr vevskultur T75 kolbe i Leibovitz L-15 medium supplert med 10% (v / v) føtalt bovint serum og 1 % penicillin-streptomycin. Inkuber i MDA-MB-231-celler i en fuktet inkubator ved 37 ° C med 0% CO 2 miljø. Slakte celler for forsøk 2 dager etter poding ved å behandle cellene med 0,25% trypsin-EDTA i 2 min og inaktivere trypsin sin enzymatiske aktivit…

Representative Results

Den utviklet parallelt microfluidic electroporator levert makromolekyler med varierte størrelser og elektriske ladninger i levende metastatisk brystkreft celler. Vellykket molekyl leveringen ble kvalitativt bestemmes ved overvåkning av endringer i de fluorescerende intensitet av electroporated kretsende celler in situ, og bekreftet ved kvantitative målinger via strømningscytometri-analyse. Figur 4A viser at 90% av behandlede celler opptak på 70 000 Da nøytral dekstran. For statistisk anal…

Discussion

Med den nye parallelized electroporation plattform, 10-ganger forbedring i hastigheten og effektiviteten av multi-molekyl levering ble oppnådd i tillegg til de fordeler som den tidligere utviklet enkeltkammersystemet gir. 18. Tidligere tilgjengelige fordeler omfatter (i) før rensing av målrette celler med ensartet størrelsesfordeling for levedyktighet forbedring, (ii) presis og individuelle molekyldoseringskontroll, og (iii) lav operativ elektrisk strøm. Fluorescensmerkede dekstraner ble valgt som moleky…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet støttes av Rowland Junior Fellow program. Forfatterne ønsker å uttrykke takknemlighet til forskere og ansatte ved Rowland Institute ved Harvard: Chris Stokes for hans hjelp i utviklingen av spesialbygde, dataassistert trykkontroll oppsett, Diane Sjakk, Ph.D. for hennes innspill for biologisk prøvehåndtering, Winfield Hill for å utvikle det elektriske oppsettet, Alavaro Sanchez, Ph.D. for å gi tilgang til strømningscytometeret, Scott Bevis, Kenny Spencer og Don Rogers for maskinering mekaniske VVS komponenter som kreves for trykk oppsett. Microfluidic mestere ble fabrikkert ved Senter for nanoskala Systems (CNS) ved Harvard University.

Materials

MDA-MB-231 cancer cell line American Type Culture Collection (ATCC) HTB-26
Leibovitz’s L-15 Medium Cellgro, Mediatech, Inc. 10-045-CV
fetal bovine serum (FBS) Gibco, Life Technologies 16000-044
penicillin-streptomycin Sigma-Aldrich P4333
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Cellgro, Mediatech, Inc. 21-030
Trypsin Gibco, Life Technologies 25200-056
Flow Cytometer easyCyte HT Millipore 0500-4008
Oxygen Plasma Cleaner Technics Micro-RIE
Dektak 6M surface profiler Veeco
KMPR 1050 Microchem
SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT Dow Corning
Compressed Nitrogen gas Airgas NI 300
High Pressure Regulator McMaster-Carr 6162K22
Downstream regulator McMaster-Carr 4000K563
high-speed 3/2way-8 valve manifold Festo
Inline Check Valve Idex Health and Science CV3320
5/32" OD x 3/32"ID Polyurethan tubes Pneumadyne PU-156F-0
1/4" OD X 0.17" ID Polyurethan tubes Pneumadyne PU-250PB-4
1/16" PEEK tubings Festo P1533
1/32" PEEK tubings Idex Health and Science P1569
PEEK tubing unions Idex Health and Science P881
Pulse Generator HP 8110A
Aluiminum Wire Bob Martin Company 6061 ALUM
oscilloscope Agilent DSO3062A
50 mL centrifuge tubes VWR 21008-178
15 mL centrifuge tube VWR 21008-216
T75 culture flask VWR 82050-862
Dextran, Tetramethylrhodamine, 3000 MW, Anionic Gibco, Life Technologies D3307
Dextran, Tetramethylrhodamine, 70,000 MW, Neutral  Gibco, Life Technologies D1819
Dextran, Texas Red, 3000 MW, Neutral Gibco, Life Technologies D3329

References

  1. Nakamura, H., Funahashi, J. Electroporation Past present and future. Dev Growth Diff. 55, 15-19 (2013).
  2. Geng, T., Lu, C. Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery. Lab Chip. 13, 3803-3821 (2013).
  3. Shahini, M., van Wijngaarden, F., Yeow, J. T. W. Fabrication of electro-microfluidic channel for single cell electroporation. Biomedical Microdevices. 15, 759-766 (2013).
  4. Neumann, E., Toensing, K., Kakorin, S., Budde, P., Frey, J. Mechanism of electroporative dye uptake by mouse B cells. Biophysical Journal. 74, 98-108 (1998).
  5. Jaroszeski, M. J., et al. Toxicity of anticancer agents mediated by electroporation in vitro. Anti-Cancer Drugs. 11, 201-208 (2000).
  6. Buntru, M., Gartner, S., Staib, L., Kreuzaler, F., Schlaich, N. Delivery of multiple transgenes to plant cells by an improved version of MultiRound Gateway technology. Transgenic Res. 22, 153-167 (2013).
  7. Mir, L. M., et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4262-4267 (1999).
  8. Heller, R., et al. Intradermal delivery of interleukin-12 plasmid DNA by in vivo electroporation. DNA Cell Biol. 20, 381-381 (2001).
  9. Boukany, P. E., et al. Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells. Nat Nanotechnol. 6, 747-754 (2011).
  10. Wang, J., et al. Synergistic Effects of Nanosecond Pulsed Electric Fields Combined with Low Concentration of Gemcitabine on Human Oral Squamous Cell Carcinoma. In Vitro PLoS One. 7, (2012).
  11. Kim, M. J., Kim, T., Cho, Y. H. Cell electroporation chip using multiple electric field zones in a single channel. Appl Phys Lett. 101, (2012).
  12. Wang, S. N., Lee, L. J. Micro-/nanofluidics based cell electroporation. Biomicrofluidics. 7, (2013).
  13. Sharei, A., et al. A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery. Proc. Natl Acad Sci USA. 110, 2082-2087 (2013).
  14. Kim, J. B., et al. Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4. Nature. 461, U649-U693 (2009).
  15. Ozbas-Turan, S., Aral, C., Kabasakal, L., Keyer-Uysal, M., Akbuga, J. Co-encapsulation of two plasmids in chitosan microspheres as a non-viral gene delivery vehicle. J Pharm Pharm Sci. 6, 27-32 (2003).
  16. Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, U311-U313 (2007).
  17. Hur, S. C., Mach, A. J., Di Carlo, D. High-throughput size-based rare cell enrichment using microscale vortices. Biomicrofluidics. 5, (2011).
  18. Yun, H. Y., Hur, S. C. Sequential multi-molecule delivery using vortex-assisted electroporation. Lab Chip. 13, 2764-2772 (2013).
  19. Gehl, J. Electroporation theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiol Scand. 177, 437-447 (2003).
  20. Wang, J., Zhan, Y. H., Ugaz, V. M., Lu, C. Vortex-assisted DNA delivery. Lab Chip. 10, 2057-2061 (2010).
  21. Jia, F. J., et al. A nonviral minicircle vector for deriving human iPS cells. Nature Methods. 7, U146-U197 (2010).
  22. Dunbar, C. E. Gene transfer to hematopoietic stem cells Implications for gene therapy of human disease. Annual Review of Medicine. 47, 11-20 (1996).
  23. Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angew Chem-Int Edit. 37, 551-575 (1998).
  24. Graziadei, L., Burfeind, P., Barsagi, D. Introduction of Unlabeled Proteins into Living Cells by Electroporation and Isolation of Viable Protein-Loaded Cells Using Dextran Fluorescein Isothiocyanate as a Marker for Protein-Uptake. Anal Biochem. 194, 198-203 (1991).
  25. Dimitrov, D. S., Sowers, A. E. Membrane Electroporation-Fast Molecular-Exchange by Electroosmosis. Biochimica Et Biophysica Acta. 1022, 381-392 (1990).
  26. Sukharev, S. I., Klenchin, V. A., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev Yu, A. Electroporation and electrophoretic DNA transfer into cells. The effect of DNA interaction with electropores. Biophysical Journal. 63, 1320-1327 (1992).
  27. Glogauer, M., McCulloch, C. A. G. Introduction of large molecules into viable fibroblasts by electroporation Optimization of loading and identification of labeled cellular compartments. Experimental Cell Research. 200, 227-234 (1992).
  28. Verspohl, E. J., KaiserlingBuddemeier, I., Wienecke, A. Introducing specific antibodies into electropermeabilized cells is a valuable tool for eliminating specific cell functions. Cell Biochemistry and Function. 15, 127-134 (1997).
check_url/kr/51702?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Vickers, D. A. L., Hur, S. C. Microscale Vortex-assisted Electroporator for Sequential Molecular Delivery. J. Vis. Exp. (90), e51702, doi:10.3791/51702 (2014).

View Video