Assay פונקציונלי לגאפ junctional בחינה; Electroporation של תאים חסידים על אינדיום הבדיל-אוקסיד
Summary
This presentation demonstrates a method whereby electroporation of adherent, cultured cells is used for the study of intercellular, junctional communication, while the cells grow on a slide coated with conductive and transparent indium-tin oxide.
Abstract
In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. A variety of molecules, such as peptides or oligonucleotides can be introduced into essentially 100% of the cells in a non-traumatic manner. Here, we describe how it can be used to study intercellular, gap junctional communication. Lucifer yellow penetrates into the cells when an electric pulse, applied to the conductive surface on which they are growing, causes pores to form through the cell membrane. This is electroporation. Cells growing on the nonconductive glass surface immediately adjacent to the electroporated region do not take up Lucifer yellow by electroporation but do acquire the fluorescent dye as it is passed to them via gap junctions that link them to the electroporated cells. The results of the transfer of dye from cell to cell can be observed microscopically under fluorescence illumination. This technique allows for precise quantitation of gap junctional communication. In addition, it can be used for the introduction of peptides or other non-permeant molecules, and the transfer of small electroporated peptides via gap junctions to inhibit the signal in the adjacent, non-electroporated cells is a powerful demonstration of signal inhibition.
Introduction
היישום של זרם חשמלי לתא גורם להיווצרות של נקבוביות על קרום התא, על ידי electroporation תהליך המכונה. הנקבוביות לאפשר המעבר של מגוון רחב של מולקולות nonpermeant דרך הממברנה. השדה החשמלי ניתן לשלוט במדויק, כך שנקבובי שנוצרו הם קטנים מאוד וreclose במהירות, עם הפרעה מינימאלית לפיסיולוגיה התאית. מעניין, ניתן לגדל תאים חסיד בשקופית זכוכית מצופה בתחמוצת מוליך ושקופה אינדיום פח (איטו) וelectroporated באתר, שעל פני השטח שבו הם גדלים, ללא ניתוק להיות electroporated בהשעיה. תאים יכולים לגדול היטב על פני השטח זה, וכפי שהם מחוברים והאריכו, התצפית מיקרוסקופית מפורטת אפשרית. שימוש בטכניקה זו, יכולה להיות הציגו מולקולות nonpermeant קטנות באופן מיידי ולמהות 100% מהתאים, מה שהופך את הטכניקה זו מתאימה במיוחד למחקרים על ההפעלה של components של מסלול בעקבות הגירוי ליגנד של קולט (שנסקר ב1).
Electroporation כבר בשימוש בעיקר עבור כניסתה של DNA (electrotransfection המכונה גם). עם זאת, electroporation באתר יכול להיות בעל ערך עבור כניסתה של מגוון רחב של מולקולות, כגון פפטידים 2-4, oligonucleotides, כגון RNA antisense, oligonucleotides פעמיים תקועים דמה DNA לעכב גורם שעתוק מחייב, או siRNA 3,5, 6 נוקלאוטידים, רדיואקטיבי 7-10, חלבוני 11 12 או בעד סמים 13. בעקבות electroporation, ניתן lysed תאים עבור ניתוחים ביוכימיים או קבוע ומוכתם עם נוגדנים.
ציפוי איטו המוליך הוא דק מאוד, 800-1,000Å, כך שצמיחת תאים אינה מופרעת על ידי ההבדל בגובה של שני משטחים, כתאים לגדול מעבר לקצה של ציפוי המוליך. זו מציעה את היתרון שאינו electropניתן לגדל תאים נאמו לצד אלה electroporated, שישמשו כבקרה. אותה הגישה יכולה לשמש לבחינת הפער junctional, תקשורת בין תאית (GJIC), כפי שמתוארת בווידאו.
צמתים פער הם ערוצים המחברים את הפנים של תאים סמוכים 14. פער junctional, תקשורת בין תאית משחקת תפקיד חשוב בהיווצרות גידולים וגרור, ואילו אונקוגנים כגון Src לדכא GJIC 15,16. כדי לבחון GJIC צבע ניאון כגון צהוב לוציפר (LY) הוא הציג לעתים קרובות לתוך תאים בתרבית באמצעות microinjection או לגרד טעינה 17 ודיפוזיה של הצבע לתוך תאים שכנים הוא ציינה מיקרוסקופי תחת תאורת פלואורסצנטי. טכניקות אלו אולם תמיד לגרום נזק לתאים. עכשיו אנו מתארים טכניקה שבה תאים גדלים בשקופית זכוכית שמצופית בחלקו עם איטו 18. דופק חשמלי היה מוחל בנוכחות LY (או צבעים אחרים) caבאמצעות החדירה שלה לתאי גידול בחלק המוליך של השקופית, ואילו הגירת צבע לתאים הסמוכים, שאינו electroporated נצפתה מיקרוסקופית באמצעות תאורת פלואורסצנטי. כדי להימנע מתאים רגישים מטרידים שעשויות נוטים להתנתק מmonolayer, הרכבה תוכננה שלא דורשת אלקטרודה שממוקמת על גבי התאים ליישם את 19 הזרם החשמלי. גישה זו מציעה את היכולת לכמת GJIC במספר גדול של תאים, ללא כל הפרעה לגילוי לחילוף חומרים תאיים, כפי שצוינה על ידי בהעדר השפעה על אורכו של שלב G1 בעקבות גירוי סרום 12, להגדיל ברמות של FOS חלבון protooncogene (Raptis, לא פורסם) או שני קינאז הקשורים ללחץ סלולארי, חזיר p38 או JNK / SAPK קינאז 1. גישה זו התאפשרה הבדיקה של הקשר בין רמות ביטוי אונקוגן, השינוי וGJ18 IC, כמו גם את ההשפעה של Src וSTAT3 על GJIC במגוון רחב של סוגי תאים, כולל תאים טריים תרבותיים מדגימות גידול ריאות 20-23. בנוסף, באתרו electroporation עם ההתקנה תוארה שאין בו אלקטרודה עליונה כבר מועסק בהצלחה להפגנה של סגירת צומת פער על בידול adipocytic, למרות שקובץ מצורף סלולארי למצע מצטמצם בשלב ש19,24.
Protocol
Representative Results
Discussion
שלבים קריטיים בפרוטוקול
חומר Electroporated
טוהר של החומר המיועד לelectroporated הוא מאוד חשוב. אם התאים מאוד שטוחים, ריכוזים אז גבוהים יותר של צבע המעקב חייבים להיות בשימוש (עד 20 מ"ג / מ"ל לLY) ובמקרים כאלה, טוהר חשוב עוד יותר מא?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Lowell Cochran for expert videography assistance. The financial assistance of the Canadian Institutes of Health Research (CIHR), the Canadian Breast Cancer Foundation (CBCF, Ontario Chapter), the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), the Canadian Breast Cancer Research Alliance, the Ontario Centers of Excellence, the Breast Cancer Action Kingston and the Clare Nelson bequest fund through grants to LR is gratefully acknowledged. SG was the recipient of an NSERC studentship. MG was supported by a postdoctoral fellowship from the US Army Breast Cancer Program, the Ministry of Research and Innovation of the Province of Ontario and the Advisory Research Committee of Queen’s University.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM | Cellgro http://www.cellgro.com/ | 50-013-PB | |
| DMEM without Calcium | Hyclone (Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com) | SH30319-01 | |
| Donor Calf Serum | PAA: http://www.paa.com/ | Cat.# B15-008 | |
| Fetal Bovine Serum | PAA: http://www.paa.com/ | Cat.# A15-751 | |
| Electroporation apparatus | Cell Projects Ltd UK: http://www.cellprojects.com/ | ACE-100 | |
| Chambers | Cell Projects Ltd UK | ACE-04-CC | 4-wells |
| Chambers | Cell Projects Ltd UK | ACE-08-CC | 8-wells |
| Lucifer Yellow | Cell Projects Ltd UK | ACE-25-LY | High purity |
| CelTak | BD Biosciences | 354240 | Cell and tissue adhesive |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| Poly-Lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
References
- Raptis, L., et al. Electroporation of Adherent Cells in Situ for the Study of Signal Transduction and Gap Junctional Communication. Electroporation protocols. , 167-183 (2008).
- Giorgetti-Peraldi, S., Ottinger, E., Wolf, G., Ye, B., Burke, T. R., Shoelson, S. E. Cellular effects of phosphotyrosine-binding domain inhibitors on insulin receptor signalling and trafficking. Mol Cell Biol. 17, 1180-1188 (1997).
- Boccaccio, C., Ando, M., Tamagnone, L., Bardelli, A., Michielli, P., Battistini, C., Comoglio, P. M. Induction of epithelial tubules by growth factor HGF depends on the STAT pathway. Nature. 391, 285-288 (1998).
- Bardelli, A., Longati, P., Gramaglia, D., Basilico, C., Tamagnone, L., Giordano, S., Ballinari, D., Michieli, P., Comoglio, P. M. Uncoupling signal transducers from oncogenic MET mutants abrogates cell transformation and inhibits invasive growth. Proc Nat Acad Sci USA. 95, 14379-14383 (1998).
- Gambarotta, G., Boccaccio, C., Giordano, S., Ando, M., Stella, M. C., Comoglio, P. M. Ets up-regulates met transcription. Oncogene. 13, 1911-1917 (1996).
- Arulanandam, R., Vultur, A., Raptis, L. Transfection techniques affecting Stat3 activity levels. Anal Biochem. 338 (1), 83-89 (2005).
- Boussiotis, V. A., Freeman, G. J., Berezovskaya, A., Barber, D. L., Nadler, L. M. Maintenance of human T cell anergy: blocking of IL-2 gene transcription by activated Rap1. Science. 278 (5335), 124-128 (1997).
- Brownell, H. L., Firth, K. L., Kawauchi, K., Delovitch, T. L., Raptis, L. A novel technique for the study of Ras activation; electroporation of [alpha-32]GTP. DNA Cell Biol. 16, 103-110 (1997).
- Tomai, E., Vultur, A., Balboa, V., Hsu, T., Brownell, H. L., Firth, K. L., Raptis, L. In situ electroporation of radioactive compounds into adherent cells. DNA Cell Biol. 22, 339-346 (2003).
- Raptis, L., Vultur, A., Tomai, E., Brownell, H. L., Firth, K. L. In situ electroporation of radioactive nucleotides: assessment of Ras activity and 32P-labelling of cellular proteins. Cell Biology A Laboratory Handbook, Celis, Ed. 43, 329-339 (2006).
- Nakashima, N., Rose, D., Xiao, S., Egawa, K., Martin, S., Haruta, T., Saltiel, A. R., Olefsky, J. M. The functional role of crk II in actin cytoskeleton organization and mitogenesis. J Biol Chem. 274, 3001-3008 (1999).
- Raptis, L., Firth, K. L. Electroporation of adherent cells in situ. DNA Cell Biol. 9, 615-621 (1990).
- Marais, R., Spooner, R. A., Stribbling, S. M., Light, Y., Martin, J., Springer, C. J. A cell surface tethered enzyme improves efficiency in gene-directed enzyme prodrug therapy. Nat Biotechnol. 15, 1373-1377 (1997).
- Nielsen, M. S., Nygaard, A. L., Sorgen, P. L., Verma, V., Delmar, M., Holstein-Rathlou, N. H. Gap junctions. Compr Physiol. 2 (3), 1981-2035 (2012).
- Geletu, M., Trotman-Grant, A., Raptis, L. Mind the gap; regulation of gap junctional, intercellular communication by the SRC oncogene product and its effectors. Anticancer Res. 32 (10), 4245-4250 (2012).
- Vinken, M., Vanhaecke, T., Papeleu, P., Snykers, S., Henkens, T., Rogiers, V. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell Signal. 18 (5), 592-600 (2006).
- Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-loading and dye transfer: A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication. Exp Cell Res. 168, 430-442 (1987).
- Raptis, L., Brownell, H. L., Firth, K. L., MacKenzie, L. W. A novel technique for the study of intercellular, junctional communication; electroporation of adherent cells on a partly conductive slide. DNA & Cell Biol. 13, 963-975 (1994).
- Anagnostopoulou, A., Cao, J., Vultur, A., Firth, K. L., Raptis, L. Examination of gap junctional, intercellular communication by in situ electroporation on two co-planar indium-tin oxide electrodes. Mol Oncol. 1, 226-231 (2007).
- Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, S., Campling, B. G., Raptis, L. A functional assay for intercellular, junctional communication in cultured human lung carcinoma cells. Lab Invest. 78, 639-640 (1998).
- Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, L. Gap junctional communication in lung carcinoma cells. Lung Cancer. 23, 223-231 (1999).
- Geletu, M., Chaize, C., Arulanandam, R., Vultur, A., Kowolik, C., Anagnostopoulou, A., Jove, R., Raptis, L. Stat3 activity is required for gap junctional permeability in normal epithelial cells and fibroblasts. DNA Cell Biol. 28, 319-327 (2009).
- Geletu, M., Arulanandam, R., Greer, S., Trotman-Grant, A., Tomai, E., Raptis, L. Stat3 is a positive regulator of gap junctional intercellular communication in cultured, human lung carcinoma cells. BMC Cancer. 12, 605 (2012).
- Brownell, H. L., Narsimhan, R., Corbley, M. J., Mann, V. M., Whitfield, J. F., Raptis, L. Ras is involved in gap junction closure in mouse fibroblasts or preadipocytes but not in differentiated adipocytes. DNA & Cell Biol. 15, 443-451 (1996).
- Weber, P. A., Chang, H. C., Spaeth, K. E., Nitsche, J. M., Nicholson, B. J. The permeability of gap junction channels to probes of different size is dependent on connexin composition and permeant-pore affinities. Biophys J. 87 (2), 958-973 (2004).
- Graham, F. L., vander Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human Adenovirus 5 DNA. Virology. 52, 456-467 (1973).
- Arulanandam, R., Vultur, A., Cao, J., Carefoot, E., Truesdell, P., Elliott, B., Larue, L., Feracci, H., Raptis, L. Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3. Mol Cancer Res 7. , 1310-1327 (2009).
- Williams, E. J., Dunican, D. J., Green, P. J., Howell, F. V., Derossi, D., Walsh, F. S., Doherty, P. Selective inhibition of growth factor-stimulated mitogenesis by a cell-permeable Grb2-binding peptide. J. Biol. Chem. 272, 22349-22354 (1997).
- Raptis, L., Brownell, H. L., Vultur, A. M., Ross, G., Tremblay, E., Elliott, B. E. Specific inhibition of Growth Factor-stimulated ERK1/2 activation in intact cells by electroporation of a Grb2-SH2 binding peptide. Cell Growth Differ. 11, 293-303 (2000).
- Meda, P. Assaying the molecular permeability of connexin channels. Methods Mol Biol. 154, 201-224 (2001).
- Hofgaard, J. P., Mollerup, S., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. Quantification of gap junctional intercellular communication based on digital image analysis. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 297 (2), R243-R247 (2009).
- Raptis, L., Lamfrom, H., Benjamin, T. L. Regulation of cellular phenotype and expression of polyomavirus middle T antigen in rat fibroblasts. Mol Cell Biol. 5, 2476-2486 (1985).
- Raptis, L., Marcellus, R. C., Whitfield, J. F. High membrane-associated protein kinase C activity correlates to tumorigenicity but not anchorage-independence in a clone of mouse NIH 3T3 cells. Exp Cell Res. 207, 152-154 (1993).
- Vultur, A., Cao, J., Arulanandam, R., Turkson, J., Jove, R., Greer, P., Craig, A., Elliott, B. E., Raptis, L. Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells. Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).
- Vultur, A., Arulanandam, R., Turkson, J., Niu, G., Jove, R., Raptis, L. Stat3 is required for full neoplastic transformation by the Simian Virus 40 Large Tumor antigen. Mol Biol Cell. 16, 3832-3846 (2005).
