Массивно-параллельных Репортер Анализы в культивируемых клетках млекопитающих

Summary

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

Abstract

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

Introduction

Массивно-параллельных Репортер Анализы (MPRA) позволяют мультиплексированную измерение транскрипционных регуляторных мероприятий тысяч до сотен тысяч последовательностей ДНК ^1-7. В своей самой общей реализации, мультиплексирование достигается путем связывания друг последовательность интерес к синтетическим геном-репортером, который содержит идентифицирующую последовательность тег ниже по потоку от открытой рамки считывания (ORF; рисунок 1). После трансфекции, выделения РНК и глубокого секвенирования концов 3 'генных транскриптов репортеров, относительные активности спаренных последовательностей может быть выведено из относительной численности идентифицирующих их меток.

Рис.1 Обзор МПРА. Библиотека MPRA репортер конструкций строится путем сочетания предполагаемые регуляторные последовательности в синтетическихрепортер гены, которые состоят из «инертного» ORF (например, GFP или люциферазы), а затем знаком идентификации последовательности. Библиотека трансфецируют массово в популяции культивируемых клеток и транскрибируется репортер мРНК впоследствии восстановлены. Глубокое последовательности используется для подсчета количества вхождений каждого тэга между репортерных мРНК и трансфицированных плазмид. Соотношение мРНК насчитывает более плазмидные отсчетов может быть использован, чтобы вывести активность соответствующей регуляторной последовательностью. Адаптировано с разрешения Мельников, и др ^2.

MPRA может быть адаптирована к большому разнообразию экспериментальных конструкций, в том числе: 1) комплексного мутагенеза регуляторных элементов индивидуальных генов, 2) сканирование для новых регуляторных элементов через локус интерес, 3) проверка эффект естественной генетической изменчивости в наборе предполагаемый промоутеры, усилители или глушители, и 4) полу-рациональное проектирование синтетических регуляторных элементов. Libraries из вариантов последовательности могут быть получены с использованием различных методов, в том числе синтеза библиотеки олигонуклеотид (МНК) на программируемых микрочипов ^2,3,6,7, собраний вырожденных олигонуклеотидов ^1,4, комбинаторной перевязки ⁸ и фрагментации геномной ДНК ^5.

Этот протокол описывает строительство библиотеки промоутер варианты использования МНК и векторы pMPRA1 и pMPRAdonor1 (Addgene идентификаторы 49349 и 49352, соответственно; http://www.addgene.org), временной трансфекции этой библиотеки в культивируемых клетках млекопитающих и последующей количественного промоторных деятельности по глубокой последовательности их соответствующими тегами (Tag-Seq). Более ранние версии этого протокола были использованы в исследованиях сообщается в Мельникова и др. Nature Biotechnology 30, 271-277 (2012) и в Kheradpour др. Genome Research 23, 800-811 (2013).

Protocol

1 Последовательность дизайн и синтез Начните MPRA с дизайном и синтеза последовательностей, которые будут исследованы на регуляторной деятельности. Для совместимости с вектором серии pMPRA, проектировать каждую последовательность, используя следующий шаблон: 5'-ACTGGCCGCTTCACTG- вар -GGTACCTCTAGA- тег -AGATCGGAAGAGCGTCG-3 ', где переменная обозначает последовательность, который надо анализировать и тег обозначает один или несколько идентифицирующих меток. Два вариабельные области (VAR и меток) разделены парой KpnI (GGTACC) и XbaI (TCTAGA) сайтов рестрикции для облегчения направленного лигирование гена репортер фрагмента между ними. Кроме того, два различных SfiI (GGCCNNNNNGGCC) сайты будут добавлены с помощью ПЦР, чтобы направленного перевязку в магистраль pMPRA. Вариабельные области не должны содержать дополнительные копии любого из этих сайтов рестрикции. Если необходимо, один или более из этих ферментов рестрикции, могут быть заменены, До тех пор, замен 1) позволяют эффективную резку близко к концам молекулы ДНК, и 2) не режут в другом месте в векторной последовательности. Смотреть Обсуждение для получения дополнительной информации. Получение необходимых праймеров, перечисленных в таблице 1, от коммерческих поставщиков. MPRA_SfiI_F GCTAAGGGCCTAACTGGCCGCTTCACTG MPRA_SfiI_R GTTTAAGGCCTCCGTGGCCGACGCTCTTC TAGseq_P1 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT TAGseq_P2 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT [индекс] GT GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGAGG Таблица 1 Последовательности праймеров. [Индекс] обозначает последовательность индекса 6 до 8 нт, используемый для мультиплексированном секвенирования. Получить по крайней мере, 8 TagSeq-P2 праймеров с различными индексами. Всепраймеров должен быть очищен с помощью ВЭЖХ или PAGE. Олигонуклеотидные библиотеки могут быть получены из коммерческих поставщиков или основного объекта, или генерируется с использованием программируемого микрочипов на основе синтезатора олигонуклеотидов, как описано производителем. Ресуспендируют продукты МНК в 100 мкл ТЕ 0,1 буфера. Запуск олигонуклеотидных библиотек на 10% КЭ-мочевины денатурирующем полиакриламидном геле. Загрузите примерно 1 пмоль на полосу и пятна с оцДНК-чувствительного флуоресцентного красителя для оценки их качества (рисунок 2А). Если дискретная полоса, соответствующая полнометражных олигонуклеотидов могут быть визуализированы (2А, дорожки 1 и 2), вырезать соответствующее акриламида гель кусочек и элюирования олигонуклеотидов в 100 мкл ТЕ 0,1 в течение ночи при комнатной температуре при встряхивании. В противном случае перейдите использованием сырьевого МНК подвеску. Amplify и добавить SFII хвосты в библиотеку олигонуклеотидным использованием эмульсии ПЦР 9 </ вир>. Установка 50 мкл реакционной смеси ПЦР, как описано в таблице 2. Затем в сочетании с 300 мкл масла и поверхностно-активной смеси от Micellula ДНК эмульсии и набора для очистки и вихря в течение 5 мин при 4 ° С. Реагент 1x Объем (мкл) Herculase II Fusion ДНК-полимеразы 0.5 Буфер Реакция 5x Herculase II 10 дНТФ (10 мм каждый) 1.25 БСА (20 мг / мл) 1.25 Грунтовка MPRA_SfiI_F (25 мкм) 0.25 Грунтовка MPRA_SfiI_R (25 мкм) 0.25 МНК шаблон (1-10 attomol) меняется Нуклеазы без воды 50 ve_content "> Таблица 2 Эмульсия реакции ПЦР смесь (водная фаза). Используйте концентрацию, которая дает максимальный выход продуктов амплификации без появления артефактов (см раздел 1.12). Разлить полученную эмульсию в ПЦР пробирок и выполнять 20 циклов ПЦР (2 мин при 95 ° С, 20 х [20 сек при 95 ° С, 20 сек при 55 ° С, 30 сек при 72 ° С], 3 мин при 95 ° C). Бассейн и разорвать каждого эмульсионного ПЦР 350 мкл добавлением 1 мл изобутанола и кратко вортексе, затем очистить продукт амплификации с использованием колонки для очистки ДНК. Запуск аликвоту на 2% или 4% агарозном геле, чтобы проверить, без артефактов амплификации (фиг.2В). На рисунке 2 Получение библиотек синтеза олигонуклеотидов.) </sЧонг> Три различных библиотек сырье синтеза олигонуклеотида (МНК) работать на денатурирующих 10% КЭ-мочевины полиакриламидном геле. Полосы, соответствующие полной олигонуклеотидов длиной (*) могут быть визуализированы и вырезали из библиотек 1 и 2 Библиотека 3 содержит загрязняющие вещества, которые мешают очистке странице. Если это так, то перейти непосредственно к ПЦР-амплификации. Б) Продукты открытой и эмульсии ПЦР-амплификации и той же библиотеки олигонуклеотид перспективе на агарозном геле. ПЦР-амплификации сложных олигонуклеотидных библиотек часто создает химерные продукты и другие артефакты, которые могут появиться как высших и низших групп. Эмульсия ПЦР может минимизировать эти артефакты. 2 Библиотека Строительство Подготовьте линеаризованную плазмиды костяк расщеплением вектора pMPRA1 с SFII при 50 ° С в течение 2 часов, запускается на 1% агарозном геле, вырезать магистральную группу (в данном случае, 2,5 кб) и очистить его с помощью спиновой колонки гель-очистки. ДайджестЭмульсионные продукты ПЦР с шагом 1,4 с SFII при 50 ° С в течение 2 ч и очистить с помощью колонки для очистки ДНК. Лигировать библиотеку промотор-тегов в линеаризованный вектор, позвоночника, создана реакции, содержащие 100 нг продукта ПЦР переваренной, 50 нг линеаризованной векторного скелета и ДНК-лигазы Т4. Инкубируют в течение ночи при 16 ° С и затем нагревают при 65 ° С в течение 20 мин для инактивации лигазы. Трансформации E. палочка с реакции лигирования. Чтобы сохранить библиотеки сложности, направлены на получение по крайней мере еще в 10 раз КОЕ чем существуют различные комбинации промотор-тегов в проектируемой библиотеки. Когда общее количество меток примерно 100000, целевая КОЕ, как правило, может быть достигнуто путем выполнения 6-8 параллельных преобразований в библиотеке. Для каждого преобразования, объединить 50 мкл Электрокомпетентные Е. палочки клетки с 2 мкл лигирования смеси на льду. Преобразование с помощью электропорации, восстановление клеток в 800 мкл SOCсредний при встряхивании при 37 ° С в течение 1 часа, а затем объединить клетки из параллельных преобразований. Чтобы оценить эффективность преобразования, плиты серийных разведений от alinquot восстановленных клеток на чашках с агаром LB, с 50-100 мкг / мл карбенициллина и инкубируют в течение ночи при 37 ° C. Оценка суммарных КОЕ как (наблюдается КОЕ) × (разведение фактором) × (V – V) / V, где V является общий объем выделенных клеток и В составляет объем аликвоты принятым для серийных разведений. В то же время, использовать остаток от выделенных клеток для инокуляции 200 мл LB с добавлением 100 мкг / мл карбенициллина. Рост клеток при 37 ° С в течение ночи в шейкере инкубаторе, а затем изолировать плазмидной ДНК в соответствии со стандартными процедурами. Дайджест аликвоту изолированной плазмиды библиотеки с SFII при 50 ° С в течение 2 ч и обрабатывают на 1% агарозном геле, чтобы подтвердить присутствие вставки. Линеаризуем библиотеку плазмиды сUtting между вариантами промоутер и тегов с использованием KpnI и XbaI. Для максимальной эффективности пищеварения, выполнять последовательные варок: Во-первых, переваривают с KpnI при 37 ° С в течение 1 ч и очистить с помощью магнитных шариков. Во-вторых, переваривают с помощью XbaI с добавлением 1 U креветок щелочной фосфатазы при 37 ° С в течение 2 ч, тепловой инактивации при 65 ° С в течение 5 мин, а затем очистить с помощью магнитных шариков. Запустите аликвоту на 1% агарозном геле для проверки полного линеаризацию. Если режиссерский плазмиды видно, Линеаризованная фрагмент должен быть геле. Чтобы создать библиотеку MPRA подходящий для трансфекции в клетки млекопитающих, перевязывать в ORF с KpnI / XbaI совместимыми с RIHD концы в линеаризованной промежуточной библиотеки. Чтобы подготовить совместимый luc2 ORF фрагмент из pMPRAdonor1, переваривать этот плазмиду с помощью KpnI и XbaI при 37 ° С в течение 1 ч и обрабатывают на 1% агарозном геле. Акцизный фрагмент ORF (1,7 Кб в данном случае) и очищают с помощью колоночной хроматографии на отжима очистки. Клонировать фрагмент ORF в линеаризованной промежуточной библиотеки, как описано в шагах 2.3-2.8. Дайджест аликвоту (соответствующий 1-2 мкг) в библиотеке MPRA с KpnI при 37 ° С в течение 1 ч и обрабатывают на 1% агарозном геле. Если переваривается библиотеки проходит в виде одной полосы, перейти к разделу 3 Если дополнительные полосы наблюдаются (обычно, соответствующий переносу промежуточных конструкций), библиотека может быть дополнительно очищен следующим образом: Дайджест 3-5 мкг загрязненной библиотеки с помощью KpnI при 37 ° С в течение 1 ч и разгон ют на 0,8% агарозном геле в течение ночи при 4 ° С. Акцизный полосы соответствующего библиотеки, очищают ДНК с использованием колонки отжима очисткой на геле и выполнять самолигирование использованием высокой концентрации ДНК-лигазы Т4 при 37 ° С в течение 1 часа. Затем повторите выделения ДНК преобразование и конечное библиотеки, как описано в шаге 2.8. 3 Transfection, возмущений, и Выделение РНК Для каждой независимой трансфекции, культуры необходимого количества клеток (как определяется сложностью библиотеки MPRA см Обсуждение) в соответствующей среде. Например, культура HEK293T / 17 клеток в среде DMEM с добавлением 10% FBS и L-глютамин / пенициллин / стрептомицин. Культуры клеток для по крайней мере двух независимых трансфекций для каждой библиотеки и экспериментальных условиях. Трансфекции культивируемых клеток с MPRA плазмид. Способ и условия трансфекции должна быть оптимизирована для каждого типа клеток. Для каждого образца трансфицированных, сохраняют аликвоту (50-100 нг) плазмидной ДНК в качестве согласованной управления. Например, трансфекции 0,5 х 10 7 HEK293T / 17 клеток, выращенных в ~ 50% слияния в 10 см блюдо культуры с 10 мкг ДНК плазмиды в 1 мл Opti-MEM я уменьшил Serum Средний использованием 30 мкл Lipofectamine LTX и 10 мкл Plus Реагент. Извлеките трансфекции смесь в течение 5 часов и позволяютКлетки для восстановления в течение 24-48 часов. При желании, выполнять любые возмущения, необходимой для активации контекстно или сигнала зависит от регуляторных последовательностей в проектируемой библиотеки. Сбора клеток и изолировать поли (A) + мРНК с использованием стандартных олиго (дТ) колонки целлюлозы или шарики с помощью инструкции их производителя. Убедитесь, что максимальное связывающая способность колонн или шарики превышать общее количество мРНК ожидать от собранных клеток. Например, ожидается, выход из секции составляет примерно 3,3 0,5-2,5 мкг мРНК. 4 Tag-Seq Чтобы устранить унос векторной ДНК из клеточных лизатов трансфицированных, относиться к каждому 20 мкл образца мРНК с 1 мкл ДНКазы Турбо (2 U) и 2,3 мкл 10х буфера Turbo ДНКазы при 37 ° С в течение 1 часа, добавляют 2,4 мкл ДНКазы Turbo инактивации реагента при комнатной температуре в течение 5 мин при перемешивании центрифуге при 10000 г в течение 90 сек, а затем передать решение в свежую пробирку. Проверьте чистота при выполнении ПЦР, как описано в разделе 4.6 на 60-100 нг каждого образца мРНК, а затем работает продукты на агарозном геле. Если видны конкретные ампликоны (0,25 кб при использовании pMPRA1 с luc2), колонка очистить обработанную мРНК, а затем повторить лечение ДНКазы. Для создания тегов-Seq библиотеки секвенирования, конвертировать репортер мРНК в кДНК и добавить секвенирования адаптеры с помощью ПЦР. Установка праймеров смеси мРНК / RT, как описано в таблице 3. Инкубируйте при 65 ° С в течение 5 мин, затем поместить на льду. Параллельно создана реакции синтеза кДНК, как описано в таблице 4. Реагент 1x Объем (мкл) мРНК образец (400-700 общей нг) 8 Олиго-0DT (50 мкм) 1 дНТФ (10 мм каждый) 1 ove_content "> Таблица 3 РНК / Обратная транскрипция грунт смесь для синтеза кДНК. Реагент 1x Объем (мкл) 10x SuperScript III RT буфера 2 MgCl 2 (25 мМ) 4 ДТТ (0,1 М) 2 RNaseOut (40 ед / мкл) 1 SuperScript III (200 ед / мкл) 1 Таблица 4 кДНК реакции синтеза смесь. Аккуратно совместить мРНК / RT грунт смешивается с синтеза кДНК смесей. Инкубируют при 50 ° С в течение 50 мин, 85 ° С в течение 5 мин, а затем поместить на льду. Наконец, инкубировать с 2 U рибонуклеазы H при 37 ° С в течение 20 мин. Установка ПЦР-реакции, как описано в таблице 5 с 4-6 мклРеакционную смесь кДНК или 50 нг плазмидой репортера в качестве шаблонов. Затем выполните ПЦР-амплификации (95 ° С в течение 2 мин, 26 х [95 ° C в течение 30 сек, 55 ° C в течение 30 сек, 72 ° C в течение 30 сек], 72 ° C в течение 3 мин). Реагент 1x Объем (мкл) 2x PfuUltra II HotStart ПЦР Master Mix 25 Грунтовка TagSeq_P1 (25 мкм) 0.5 Грунтовка TagSeq_P2 (25 мкм) 0.5 Шаблон (мРНК, кДНК смесь или ДНК плазмиды) меняется Нуклеазы без воды 50 Таблица 5 Tag-Seq реакции ПЦР смесь. Запуск продуктов ПЦР через 2% агарозном геле, акцизные полос, соответствующих тегов-Seq библиотечных ампликонов (0,25 кб при использованииpMPRA1 с luc2) и очистить эти помощью спиновых столбцы очистки гель. Бассейн, денатурации и последовательности очищенные Tag-Seq ампликоны непосредственно с секвенирования Illumina инструмента. Фильтр низкого качества читает, удаляя все, что есть) содержат один или несколько позиций с качеством Phred набрали менее 30 в секвенированного тега или б) не точно соответствует проектную тег. Подсчитайте, сколько раз каждый из оставшихся тег появляется в каждой библиотеке. Нормализовать счетчики тегов для TPM (теги на миллион секвенированных тегов), а затем вычислить соотношение количества мРНК-полученных отсчетов тегов над плазмиды полученных тегов пунктам для каждой пары секвенирования библиотек. Если несколько разных теги были связаны с каждого варианта последовательности, использовать их медианные показатели для последующего анализа.

Representative Results

MPRA облегчает высоким разрешением, количественный рассечение последовательность-активность транскрипционных регуляторных элементов. Успешный эксперимент MPRA обычно дают высокую воспроизводимость измерений для большинства последовательностей в трансфецированного библиотеки (Рисунок 3А). Если плохая воспроизводимость наблюдается (фигура 3В), то это свидетельствует о слишком низкой концентрации репортерных мРНК в восстановленных образцов РНК, в результате либо 1) низкой абсолютной активности среди проанализированных последовательностей, или 2) низкой эффективности трансфекции. Рисунок 4 показывает характерный "информационный след" 1,2 сгенерированный путем анализа ~ 37000 случайные варианты последовательности 145 б.п. выше гена человека IFNB в НЕК293 с или без контакта с вирусом Сендай. Промоутер TATA-бокс и известный проксимального усилитель 10 может быть четко определены как информационно насыщенной регидополнений в вирус-зависимым образом. Рисунок 3 Tag-Seq воспроизводимость. Диаграммы разброса, показывающие примеры Tag-Seq данных двух независимых повторных трансфекций с высокой (А) и низкой (B) воспроизводимости. Последний график показывает много выброса теги с высокой мРНК пунктам только в одном из двух повторах. Такие артефакты, как правило, указывают, что концентрации репортерных мРНК были слишком низкими для количественной ПЦР-амплификации, либо в результате низких абсолютных деятельности между репортерных конструкций или низкой эффективности трансфекции. Рисунок 4 Информация футпринтинга человеческого стартового сайта IFNB транскрипции и проксимального усилителя. </strОнг> Примерно 37000 случайные варианты в 145 нуклеотидов (нт) области выше гена IFNB человека анализировали с помощью MPRA в НЕК293 с (А) и без (B) воздействия вируса Сендай. Синие столбики показывают взаимную информацию между выходом репортера и нуклеотида в каждой позиции. Проксимальный усилитель и TATA-бокс выделяются как области с высокой информативностью при вирусной инфекции.

Discussion

MPRA is a flexible and powerful tool for dissection of sequence-activity relationships in gene regulatory elements. The success of MPRA experiments depend on at least three factors: 1) careful design of the sequence library, 2) minimization of artifacts during amplification and cloning, and 3) high transfection efficiency.

The possible lengths of the variable regions in the reporter constructs are largely determined by the synthesis or cloning technology used. Standard OLS is generally limited to about 200 nt, but this protocol is compatible with inserts up to at least 1,000 nt. Note that variable regions that are highly repetitive or contain strong secondary structures may end up underrepresented due to PCR and cloning biases. The length of the tags that identify each of the variable regions should be 10-20 nt and the collection of tags should ideally be designed such there are at least two nucleotide differences between any pair. Tags that contain the seed sequences of known microRNA or other factors that might influence mRNA stability should also be avoided when possible.

A key parameter in the design of MPRA experiments is the total number of distinct reporter constructs to be included in the library (the design complexity, denoted C_D). In practice, C_D is limited by the number of cultured cells that can be transfected. As a rule of thumb, the total number of transfected cells should be at least 50-100 times greater than C_D. For example, if 20 million cells can be transfected with a transfection efficiency of 50%, then C_D should be no more than ~200,000. Note that C_D is equal to the number of distinct regulatory sequence variants multiplied by the number of distinct tags per sequence. The more distinct tags are linked to each regulatory sequence, the more accurate the estimate of the activity of that sequence can be made (because measurements from distinct tags can be averaged), but the fewer distinct variants can be assayed in one experiment. The optimal choice depends on the experimental design. In a simple “promoter bashing” experiment, where a mathematical model will be fitted to the aggregated measurements, a single tag per variant is usually sufficient. In a screen for single-nucleotide polymorphisms that cause changes in regulatory activities, it may be necessary to use 20 or more tags per allele to obtain statistically robust results, because comparing each pair of alleles requires a separate hypothesis test.

If the sequences to be assayed are not expected to contain transcription start sites, a constant promoter can also be added in the same fragment. For example, pMPRAdonor2 (Addgene ID 49353) includes a minimal TATA-box promoter that is useful when the upstream variable region is expected to have significant enhancer activity, while pMPRAdonor3 (Addgene ID 49354) includes a modified, strong SV40 viral promoter that is useful when the variable region is expected to contain silencer activity or other negative regulatory elements.

Raw OLS products often contain a significant fraction of truncated oligonucleotides. These may interfere with accurate PCR amplification of the designed sequences, particularly when there is significant homology between them. Using PAGE purification to remove truncated synthesis products and emulsion PCR to minimize amplification artifacts are effective techniques for ensuring high library quality. If either step is impractical, it is imperative to minimize the number of PCR cycles used at each amplification step. Selection and expansion of the cloned library in liquid culture is generally sufficient to maintain the design complexity, but if recombination-prone vectors are to be used or significant representation bias is observed, the recovered cells can instead be plated directly onto large LB agar plates, expanded as individual colonies and then scraped off for DNA isolation. It is also important to consider the potential impact of synthesis errors, which are typically found at a rate of 1:100-500 in OLS. Full-length sequencing of the reporter constructs prior to transfection is recommended to identify and correct for such errors.

It is not necessary to introduce reporter constructs into every cell in the transfected culture, but transfection efficiencies below ~50% may lead to poor signal to noise ratios. It is advisable to optimize transfection conditions prior to performing MPRA experiments in a new cell type. When working with hard-to-transfect cell types, MPRA signals can be boosted by pre-selecting transfected cells. The pMPRA vector series includes variants that constitutively express a truncated cell surface marker that can be used to physically enrich for transfected cells prior to RNA isolation (for example, Addgene IDs 49350 and 49351).

Materials

Oligonucleotide library synthesis	Agilent, CustomArray or other OLS vendors	custom	If using OLS construction method
pMPRA1	Addgene	49349	MPRA plasmid backbone
pMPRAdonor1	Addgene	49352	luc2 ORF donor plasmid
TE 0.1 Buffer (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0)	Generic	n/a	OLS buffer
Novex TBE-Urea Gels, 10%	Life Technologies	EC6875BOX	PAGE purification of OLS products
Novex TBA-Urea Sample Buffer	Life Technologies	LC6876	PAGE purification of OLS products
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain	Life Technologies	S-11494	PAGE purification of OLS products
Micellula DNA Emulsion & Purification Kit	EURx/CHIMERx	3600-01	Library amplification by emulsion PCR
Herculase II Fusion DNA Polymerase	Agilent	600675	Polymerase for emulsion PCR
SfiI	New England Biolabs	R0123S	Library cloning with pMPRA vectors
KpnI-HF	New England Biolabs	R3142S	Library cloning with pMPRA vectors
XbaI	New England Biolabs	R0145S	Library cloning with pMPRA vectors
T4 DNA Ligase (2,000,000 units/ml)	New England Biolabs	M0202T	Library cloning with pMPRA vectors
One Shot TOP10 Electrocomp E. coli	Life Technologies	C4040-50	Library cloning with pMPRA vectors
LB agar and liquid media with carbenicllin	Generic	n/a	Growth media for cloning
E-Gel EX Gels 1%	Life Technologies	G4010-01	Library verification and purification
E-Gel EX Gels, 2%	Life Technologies	G4010-02	Library verification and purification
MinElute Gel Extraction Kit	Qiagen	28604	Library and backbone purification
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362	Library DNA isolation
Cell culture media	n/a	n/a	Experiment-specific
Transfection reagents	n/a	n/a	Experiment-specific
MicroPoly(A)Purist Kit	Life Technologies	AM1919	mRNA isolation
TURBO DNA-free Kit	Life Technologies	AM1907	Plasmid DNA removal
SuperScript III First-Strand Synthesis System	Life Technologies	18080-051	cDNA synthesis
PfuUltra II Hotstart PCR Master Mix	Agilent	600850	Polymerase for Tag-Seq PCR
Primers (see text)	IDT	custom	PAGE purify Tag-Seq primers