Generazione e Purificazione di umani INO80 rimodellamento della cromatina Complessi e Sottocomplessi
Summary
Questo protocollo descrive una procedura per la generazione e purificare wild type e mutanti versioni del complesso rimodellamento della cromatina INO80 umana. Epitopi tagged versioni di subunità INO80 sono stabilmente espressi in cellule HEK293 e complessi completi e complessi privi di specifici gruppi di subunità sono purificati mediante cromatografia di immunoaffinità.
Abstract
INO80 complessi di rimodellamento della cromatina regolano le dinamiche nucleosoma e l'accessibilità del DNA catalizzando ATP-dipendente rimodellamento nucleosoma. Complessi INO80 umani sono composti da 14 subunità proteiche tra cui INO80, un SNF2-come ATPasi, che serve sia come la subunità catalitica e il patibolo per l'assemblaggio dei complessi. Funzioni delle altre subunità ei meccanismi attraverso i quali essi contribuiscono alla cromatina attività rimodellamento del complesso del INO80 rimangono poco conosciuti, in parte a causa della sfida di generare sottoinsiemi INO80 nelle cellule umane o sistemi di espressione eterologhi. Questo protocollo JOVE descrive una procedura che permette la purificazione di INO80 cromatina Sottocomplessi rimodellamento umani che mancano di una subunità o un sottoinsieme di subunità. N-terminale epitopo FLAG tagged INO80 cDNA vengono stabilmente introdotte nel rene embrionale umano (HEK) 293 linee cellulari con ricombinazione Flp-mediata. Nel caso in cui un sottoinsieme di subunità del complesso INO80 è abe cancellato, si esprime invece le proteine mutanti INO80 che non hanno la piattaforma necessaria per il montaggio di queste subunità. Nel caso in cui un individuo subunità deve essere impoverito, uno transfects di targeting siRNA questa subunità in una linea cellulare HEK 293 che esprimono stabilmente FLAG taggati INO80 ATPasi. Estratti nucleari sono preparate, e FLAG immunoprecipitazione viene effettuata per arricchire frazioni proteiche contenenti derivati INO80. Le composizioni di Sottocomplessi INO80 purificati possono poi essere analizzati utilizzando metodi quali immunoblotting, colorazione argento, e spettrometria di massa. I Sottocomplessi INO80 e INO80 generati in base a questo protocollo possono essere ulteriormente analizzati utilizzando vari saggi biochimici, che sono descritte nel protocollo JOVE accompagnamento. I metodi qui descritti possono essere adattati per lo studio delle proprietà strutturali e funzionali di ogni mammifero multi-subunità rimodellamento della cromatina e complessi modificano.
Introduction
Evolutivamente conservata di famiglia SNF2 complessi di rimodellamento della cromatina sono regolatori chiave di organizzazione della cromatina e l'accessibilità del DNA 1. Questi complessi di rimodellamento comprendono sempre una centrale SNF2-come ATPasi subunità, che, in alcuni casi, assembla con diverse proteine accessorie e forma macro-molecolare assiemi multi-subunità. Per studiare i dettagli molecolari del processo di rimodellamento della cromatina ATP-dipendente, è importante comprendere i contributi di determinati sottoinsiemi di subunità e / o strutture di dominio per le attività dei complessi. Tali analisi richiedono la capacità di generare complessi mutanti altamente purificate che non hanno particolari subunità proteiche o strutture di dominio.
Precedenti studi struttura-funzione di ATP-dipendenti complessi di rimodellamento della cromatina sono ampiamente concentrata sul sistema modello di lievito a causa della manipolabilità superiore del genoma del lievito (vedi, per esempio, arbitri 1-4). Data la conservazione deglicomposizione subunità e funzionalità tra complessi di rimodellamento ortologhi, studi sulla struttura e la funzione dei lieviti complessi di rimodellamento hanno fornito importanti informazioni nelle loro controparti in eucarioti superiori. Tuttavia, esistono specie-specifici apprezzabili differenze tra i complessi di rimodellamento, derivante dalla plusvalenza o la perdita di specie-specifica subunità, il guadagno o la perdita di domini specie-specifici della subunità conservati, e la variabilità di sequenza all'interno di domini conservati di subunità conservati. Tali differenze possono in linea di principio essere guidati dalla necessità di cellule eucariotiche superiori di adattarsi a nuovi ambienti molecolari e cellulari. Quindi, capire come subunità di maggiori complessi di rimodellamento eucarioti contribuiscono al processo di rimodellamento nucleosoma è prezioso, perché getta luce non solo sui meccanismi di base del processo di rimodellamento della cromatina ATP-dipendente, ma anche in grado di fornire preziose informazioni sui meccanismi attraverso cui la struttura della cromatina e l'espressione genica in higsuoi eucarioti sono regolati.
Finora, ci sono stati solo limitati studi strutturali e funzionali di multi-subunità mammiferi complessi di rimodellamento della cromatina, in parte a causa delle difficoltà nell'ottenere biochimicamente definiti complessi di rimodellamento della cromatina e Sottocomplessi. Abbiamo parzialmente aggirato queste difficoltà con le procedure descritte qui di seguito, in cui la purificazione per immunoaffinità viene utilizzato per preparare intatti INO80 o INO80 Sottocomplessi da cellule umane che esprimono stabilmente N-terminale epitopo FLAG tag wild type o mutanti versioni di INO80 5-7 (Figura 1) . Per ottenere complessi INO80 intatte da cellule umane, ricombinazione Flp-mediata viene utilizzato per generare linee cellulari transgeniche HEK293 stabilmente esprimenti epitopi FLAG cDNA taggati codificano per le subunità del complesso INO80 8-10. Poiché sovra-espressione di subunità INO80 può essere alquanto tossico, è necessario isolare e mantenere linee cellulari clonali sotto co selettivalli operativi per garantire l'espressione stabile del transgene durante i numerosi passaggi necessari per l'espansione delle colture cellulari su larga scala. Per ottenere Sottocomplessi INO80 più piccoli che contengono solo un sottoinsieme di subunità, abbiamo utilizzato con successo due approcci (Figura 2A, B). Nel primo, generiamo linee cellulari HEK293 Flp-In esprimono stabilmente versioni mutanti di INO80 che mancano i domini necessari per l'interazione con le subunità specifiche 5. In alternativa, knockdown siRNA-mediata è utilizzato per esaurire la subunità desiderato da cellule che esprimono un adeguato INO80 subunità FLAG-tag (dati non pubblicati). Infine, per purificare i complessi INO80 umani, FLAG cromatografia a base di agarosio 11 viene utilizzato per arricchire una frazione-INO80 contenente da estratti nucleari, riducendo efficacemente la presenza di contaminanti proteine citosoliche nella frazione finale contenente depurati INO80 o INO80 Sottocomplessi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studi strutturali e funzionali di multi-subunità complessi di rimodellamento della cromatina mammiferi da eucarioti superiori sono stati ostacolati dalla difficoltà di preparare biochimicamente quantità utili di tali complessi contenenti subunità mutante o privi di alcune subunità del tutto. Ci sono una serie di ostacoli tecnici: In primo luogo, la manipolazione genetica in cellule di mammifero è stato tecnicamente impegnativo e richiede tempo. A differenza delle cellule di lievito, il cui genoma può essere facil…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lavoro in laboratorio degli autori è supportata da una sovvenzione da parte del National Institute of scienze mediche generali (GM41628) e da una sovvenzione all'Istituto Stowers per la ricerca medica da Helen Nelson Medical Research Fund presso la Greater Kansas City Community Foundation.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Cellgro | 10-013-CV | |
| Glutamax-I (stablized glutamine) | Life Technologies | 35050-079 | |
| Fetal Bovine Serum | SAFC | 12176C | |
| FuGENE6 transfection reagent | Promega | E2312 | |
| Hygromycin B, sterile in PBS | AG Scientific | H-1012-PBS | |
| pcDNA5/FRT vector | Life Technologies | V6010-20 | |
| Flp-In HEK293 cells | Life Technologies | R780-07 | |
| pOG44 Flp-Recombinase Expression Vector | Life Technologies | V600520 | |
| EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | F2426 | |
| calf serum | SAFC | 12138C | |
| TARGETplus SMARTsiRNA pool | Dharmacon / Thermo Scientific | various | |
| 5x siRNA resuspension buffer | Dharmacon / Thermo Scientific | #B-002000-UB-100 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Life Technologies | 51985-091 | |
| PBS | Cellgro | 45000 | VWR |
| TrypLE (trypsin) | Life Technologies | 12604 | |
| 1x FLAG Peptide | Sigma | F3290 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Column | Bio-Rad | 737-5021 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (50k MWCO) | Amicon | UFC805024 | Fisher Scientific |
| Zeba Desalting Columns | Thermo Scientific | 89882 | |
| Anti-FLAG M2 antibody, mouse | Sigma | F3165 | |
| Anti-FLAG M2 antibody, rabbit | Sigma | F7425 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | |
| benzonase | Novagen | 70664 | |
| Equipment | Company | ||
| Wheaton Dounce Tissue Grinders | Wheaton | 06-435C | |
| JS-4.2 rotor in a J6 centrifuge | Beckman-Coulter | 339080 | |
| JA-17 rotor | Beckman-Coulter | 369691 | |
| 10 ml polycarbonate tubes | Beckman-Coulter | 355630 | |
| 70 ml polycarbonate bottles | Beckman-Coulter | 355655 | |
| Type 45 Ti rotor | Beckman-Coulter | 339160 | |
| Type 70.1 Ti rotor | Beckman-Coulter | 342184 | |
| BD Clay Adams Nutator Mixer | BD Diagnostics | 15172-203 | VWR |
| Glas-Col Tube/Vial Rotator | Glas-Col | 099A RD4512 | |
| PCR thermal cycler PTC 200 | MJ Research | PTC 200 | |
| roller bottle incubator | Bellco biotechnology | 353348 | |
| Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4 | Millipore | IPFL07810 | |
| lubricated 1.5ml microcentrifuge tubes | Costar | 3207 |
References
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