マウスドーパミン作動性ニューロンの初代培養
Summary
Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson’s disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.
Abstract
ドーパミン作動性ニューロンは、脳におけるニューロンの総数の1％未満を表す。ニューロンのこの低い量は、モータ制御、モチベーション、およびワーキングメモリなどの重要な脳の機能を調節する。黒質線条体ドーパミン作動性ニューロンを選択的にパーキンソン病（PD）に変性する。この進行性の神経細胞の損失は、明確に病理のモータ症状（動作緩慢、安静時振戦、筋固縮と）に関連付けられています。ドーパミン作動性ニューロン変性の責任を主剤はまだ不明です。しかし、これらのニューロンは、多様な条件で非常に脆弱であることが表示されます。初代培養は、ドーパミン作動性ニューロンの特性および特徴を調べるため、最も関連性の高いモデルの一つを構成する。これらの培養物を停止またはニューロン変性を遅くするために、PDの病理を模倣するさまざまなストレス剤および神経保護化合物に提出することができます。 GENERていたPDの多数のトランスジェニックマウスモデル過去10年間にatedはさらにドーパミン作動性ニューロン培養のための研究者の関心を増大させた。ここで、ビデオプロトコルは、マウス胎児の脳の繊細な解剖に焦点を当てています。腹側中脳の正確な切除がその後の研究を可能にするためにドーパミン作動性細胞において十分に豊富な神経細胞培養を得ることが重要です。このプロトコルは、胚のトランスジェニックマウスを用いて実現し、免疫蛍光染色、定量PCR、セカンドメッセンジャーの定量化、または神経細胞死/生存性評価に適していることができます。
Introduction
ドーパミンは、本質的な脳の神経伝達物質1,2の一方は、主として中脳ドーパミン作動性（DA）ニューロンによって放出される。 DAニューロンの大部分は、中脳2-6の腹の部分に存在します。概略的に、中脳DAニューロンは3解剖学的および機能的に異なる投影システムに分けることができます。mesostriatal、中脳辺縁系、および中間皮質経路2,5。前頭前皮質に突出するドーパミン作動性経路が認知2に関係しているのに対し、黒質線条体経路は、中脳辺縁系経路が強化、モチベーション、学習に重要な役割を果たし、運動行動に関与している。
DAニューロンは、統合失調症、注意欠陥、過活動障害、及びパーキンソン病（PD）2,4のようないくつかのヒト神経疾患に関与している。 PDは、黒質を接続するDAニューロンの進行性かつ選択的な変性によって特徴づけられる線条体への緻密部（SNC）。 PDの運動症状の責任がある線条体における深刻なドーパミン枯渇黒質線条体DAニューロン結果の損失（動作緩慢、安静時振戦、及び剛性）7。線条体におけるドーパミンレベルの復元を目指し、特発性PDの初期の原因は確立されておらず、現在の治療法は対症療法のみである。最も多く処方された薬物は、L-ドーパ（レボドパ）、ドーパミンの自然な前駆体である。レボドパの投与は、一定時間ドーパミンの損失を補償するのに、運動合併症は、長期間の治療（ジスキネジーおよびオン/オフ状態）8,9を生じる。
ドーパミン作動性ニューロンおよびPDの研究は、一定の進行であり、強烈な努力が細胞移植、遺伝子治療、または神経保護剤10,11に基づいて治療法を開発するために行われている。しかし、大きな問題は、非解明のまま：極端なvulnerabの原因が何であるかDAニューロンのility？その答えの一部は、DAニューロンの活動で見つけることができます。電気的活動およびDAニューロンの興奮性の減少は、12を縮退させる彼らの傾向を増大させると思われる。それにもかかわらず、PDの病因の複雑さは、DAニューロンに関与する機構は13-15退化識別するために、さらなる研究が必要である。
初代培養は、DAニューロンの性質16-19を研究すると、神経保護剤20〜24の評価のためにさまざまなストレスにこれらのニューロンに挑戦することが特に関連しています。ラット培養モデルは、ほとんどの場合、ラット胚中脳の解剖が容易であるように、マウスと比べて、ニューロンのより高い量は、ラットで得ることができ、使用されている。しかし、病気25のトランスジェニックマウスモデルの生成が大幅にマウス26-29からの初代培養のための神経科学コミュニティの関心が高まっている。広報文化ものの生まれたばかりの動物からepared使用することができ、それが神経細胞が分化する能力を保持しているときには、有糸分裂後の段階（中脳の神経細胞のためE13.5）で胚からそれらを準備することをお勧めします。以下のプロトコルを準備することが最も困難であるマウス胚（E13.5）からの初代培養中の単離中脳ニューロンを提示します。注目すべきことに、私たちは、より良い再現性のために、無血清培地を使用してプロトコルを提供する。培養の準備（解剖および機械的解離）内の2つの最も重要なステップは慎重に関連したビデオの中で詳細に説明する。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、ドーパミン作動性ニューロンを検出するために、胚性マウスと免疫蛍光手順から中脳ニューロンの初代培養を調製するのに必要な手順および試薬を提供する。手順の重要なステップは、胚の解剖し、収集脳断片の機械的解離である。高品質の解剖器具解剖技術を習得するのに役立ちます。 DAニューロンは、中脳のごく一部を構成している。したがって、腹側中脳の右側部?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supported by grants from CNRS and INSERM. PM acknowledges support from the Fondation pour la Recherche Médicale en France (Equipe FRM 2009). SC acknowledges support from the Fondation de France.
Materials
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| DMEM 4.5g/L Glucose with L-Glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X), Phenol Red | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
| L-glutamine, 200 mM Solution | Life Technologies | 25030123 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma-Aldrich | D0547 | Powder |
| Laminin – 1 mg/mL in Tris buffered NaCl | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Poly-L-Ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Insulin from porcine pancreas | Sigma-Aldrich | I5523 | |
| apo-Transferrin human | Sigma-Aldrich | T1147 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | Stock solution 1M in water |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Stock solution 2% (w/v) in water |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Paraformaldehyde 16% in water | Electron Microscopy Sciences | RT 15710-S | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Merck Millipore | 106329 | |
| D(+)-Glucose, Monohydrate | Merck Millipore | 4074-2 | |
| Hydrochloric acid – c(HCl) = 1 mol/l (1 N) Titripur | Merck Millipore | 109057 | |
| Sterile water – Aqua B. Braun | Braun | ||
| Ethanol absolute NORMAPUR analytical reagent | VWR | 20821.321 | |
| Sterile Petri Dishes | VWR | 82050-566 | |
| Pasteur pipettes plain glass – Wilhem Ulbrich GdbR. | VWR | 612-2297 | |
| Counting chamber Malassez | VWR | 631-0975 | |
| Serum Acrodisc Syringe Filter with Supor Membrane, Sterile, GF/0.2 µm, 37 mm | PALL Life science | 4525 | |
| Surgical Scissors – Straight, sharp-sharp, 14.5 cm long | Fine Science Tools | 14002-14 | To open the abdominal wall |
| Scissors – Straight, pointed, delicate, 10 cm long | MORIA | 4877A | To open the uterine wall |
| Forceps – Curved, usual, serrated jaws 1 mm | MORIA | 2183 | To manipulate embryos |
| Vannas Scissors – Curved, pointed, 7 mm blades | MORIA | MC50 | To take out the mesencephalon |
| Ultra Fine Forceps – Curved, delicate, 13 cm long | MORIA | 9987 | To remove meninges |
| BD BioCoat Poly-D-Lysine 24-well Multiwell Plates | BD Bioscience | 356414 | |
| BD Falcon 12-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid | BD Bioscience | 353043 | |
| SuperFrost Microscope Slides, Ground edges 90º | MENZEL-GLÄSER | AG00008032E | |
| Precision cover glasses thickness No. 1.5H circular 18 mm Ø | MARIENFELD | 117580 | |
| Polyclonal Rabbit Anti-Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) Antibody | Chemicon Millipore | AB5622 | 1/200 |
| Monoclonal Mouse Anti-Glutamate Decarboxylase (GAD67) Antibody, clone 1G10.2 | Chemicon Millipore | MAB5406 | 1/400 |
| Monoclonal Rat Anti-Dopamine Transporter (DAT) Antibody, clone DAT-Nt | Chemicon Millipore | MAB369 | 1/500 |
| Monoclonal Mouse Anti-5-HT Antibody | 1/8,000 – Generous gift from Yves Charnay (Swizerland, Yves.Charnay@hcuge.ch) | ||
| Goat Serum, New Zealand Origin | Life Technologies | 16210-064 | |
| Alexa Fluor 405 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-31556 | 1/200 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11001 | 1/1000 |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11007 | 1/1000 |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss microscopy | Stemi-2000C | |
| Bunsen Burner FIREBOY | VWR | 451-0136 |
References
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