יסודי תרבות של עכבר דופאמין נוירונים
Summary
Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson’s disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.
Abstract
נוירונים דופאמין מהווים פחות מ -1% מהמספר הכולל של תאי עצב במוח. סכום זה נמוך של תאי עצב מווסת את תפקודי מוח חשובים כגון שליטה מוטורית, מוטיבציה, וזיכרון עבודה. נוירונים דופאמין Nigrostriatal להידרדר באופן סלקטיבי במחלת פרקינסון (PD). איבוד עצבי מתקדם זה קשור באופן חד משמעי עם הסימפטומים מנועים של פתולוגיה (bradykinesia, רעד במנוחה, נוקשות שרירים ו). הסוכן העיקרי האחראי לניוון תא עצב דופאמין הוא עדיין לא ידוע. עם זאת, נוירונים אלה מופיעים להיות מאוד פגיעים בתנאים מגוונים. תרבויות עיקריות מהוות אחד המודלים הרלוונטיים ביותר לחקור תכונות ומאפיינים של נוירונים דופאמין. ניתן להגיש תרבויות אלה לסוכני מתח שונים המחקים פתולוגיה PD ותרכובות הגנה עצביות על מנת לעצור או להאט את הניוון עצבי. מודלים רבים מהונדסים העכבר של PD כי כבר generated בעשור האחרון גדל עוד יותר את האינטרס של חוקרים לתרבויות נוירון דופאמין. הנה, פרוטוקול הווידאו מתמקד בנתיחה העדינה של מוח עכבר העוברי. כריתה מדויקת של mesencephalon הגחון היא חיונית כדי להשיג תרבויות עצביות מספיק עשירות בתאי דופאמין כדי לאפשר מחקרים עוקבים. פרוטוקול זה יכול להתממש עם עכברים הטרנסגניים עובריים ומתאים לצביעת immunofluorescence, PCR כמותי, כימות שליח שני, או הערכת מוות / הישרדות עצבית.
Introduction
דופמין, אחד מהמוליכים העצביים במוח החיוני 1,2, בעיקר שפורסם על ידי דופאמין המוח התיכון הנוירונים (DA). רוב הנוירונים DA מתגוררים בחלק הגחוני של mesencephalon 2-6. סכמטי, ניתן לחלק את תאי עצב DA המוח התיכון בשלוש מבחינה אנטומית ותפקודי של מערכות שונות הקרנה: mesostriatal, mesolimbic, ומסלולי mesocortical 2,5. מסלול nigrostriatal מעורב במנוע התנהגות, מסלולי mesolimbic לשחק תפקיד חשוב בחיזוק, מוטיבציה, ולמידה, ואילו מסלולי דופאמין מקרינים לקליפת מוח הקדם חזיתית הם מעורבים בקוגניציה 2.
נוירונים DA מעורבים בכמה הפרעות נוירולוגיות אדם כמו סכיזופרניה, קשב וריכוז, הפרעת פעילות יתר, והמחלה (PD) פרקינסון 2,4. PD מתאפיין בניוון מתקדם וסלקטיבי של תאי עצב DA חיבור nigra substantiacompacta Pars (SNC) לסטריאטום. הפסד של תוצאות נוירונים DA Nigro-striatal בדלדול הדופמין החמור בסטריאטום, כי הוא אחראי לתסמינים המוטוריים של מחלת הפרקינסון (bradykinesia, רעד במנוחה, נוקשות) 7. הגורם הראשוני לPD אידיופטית לא הוקם והטיפולים הנוכחיים הם רק סימפטום, במטרה להחזיר את רמת הדופמין בסטריאטום. התרופה המומלצת ביותר היא L-דופא (Levodopa), המבשר הטבעי של דופמין. למרות שהממשל של Levodopa מפצה על האובדן של דופאמין למשך פרק זמן מסוים, סיבוכים מוטוריים להתרחש לאחר טיפולים ארוכי טווח (dyskinesia והפעלה / כיבוי מדינות) 8,9.
מחקר על נוירונים דופאמין ופ"ד הוא בהתקדמות מתמדת ומאמצים אינטנסיביים נעשים כדי לפתח טיפולים הבוסס על השתלת תאים, ריפוי גנטי, או סוכני הגנה עצביים 10,11. עם זאת, נושא מרכזי נשאר לא הובהר: מה הוא הגורם של vulnerab הקיצוניility של נוירונים DA? ניתן למצוא חלק מהתשובה בפעילות של תאי עצב DA. נראית ירידה בפעילות החשמלית ושל הרגישות של תאי עצב DA כדי להגדיל את נטייתם להידרדר 12. אף על פי כן, את המורכבות של הפתוגנזה פ"ד דורשים מחקרים נוספים על מנת לזהות את המנגנונים מעורבים בDA נוירונים ניוון 13-15.
תרבויות עיקריות רלוונטיות במיוחד ללמוד תכונות תא עצב DA 16-19 ולקרוא תיגר על הנוירונים האלה ללחצים שונים להערכה של סוכני הגנה עצביים 20-24. מודלים תרבות עכברוש משמשים בתדירות הגבוהה ביותר, כפי שהנתיחה של mesencephalon עובר עכברוש היא קלה יותר, בהשוואה לעכבר, וניתן לקבל כמויות גדולות יותר של תאי עצב בחולדות. עם זאת, דור של דגמי עכבר מהונדסים של המחלה 25 יש מידה ניכרת הגדיל את האינטרס של קהילת מדען המוח לתרבויות עיקריות מהעכבר 26-29. למרות שתרבויות יחסי ציבורepared מבעלי חיים שזה עתה נולדו יכול לשמש, עדיף להכין אותם מעוברים בשלב שלאחר mitotic (E13.5 לנוירונים mesencephalon), כאשר נוירונים שמרו היכולת שלהם להבחין. הפרוטוקול הבא מציג נוירונים mesencephalon מבודדים בתרבות העיקרית מעוברי עכברים (E13.5), שהם קשים ביותר להכנה. יש לציין, אנו מספקים פרוטוקול באמצעות מדיום סרום ללא תרבות לשחזור טוב יותר. שני השלבים הקריטיים ביותר בהכנת התרבות (לנתיחה וניתוק מכאני) שיפורטו בזהירות בווידאו קשור.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מציג את הנהלים וחומרים כימיים הדרושים כדי להכין את התרבות העיקרית של נוירונים mesencephalic מהעכבר העוברי והליך immunofluorescence לזהות נוירונים דופאמין. שלבים קריטיים של ההליך הם לנתיחה של העוברים והניתוק המכני של שברי המוח שנאספו. מכשירים לנתיחה באיכות גבוהים מסיי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supported by grants from CNRS and INSERM. PM acknowledges support from the Fondation pour la Recherche Médicale en France (Equipe FRM 2009). SC acknowledges support from the Fondation de France.
Materials
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| DMEM 4.5g/L Glucose with L-Glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X), Phenol Red | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
| L-glutamine, 200 mM Solution | Life Technologies | 25030123 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma-Aldrich | D0547 | Powder |
| Laminin – 1 mg/mL in Tris buffered NaCl | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Poly-L-Ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Insulin from porcine pancreas | Sigma-Aldrich | I5523 | |
| apo-Transferrin human | Sigma-Aldrich | T1147 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | Stock solution 1M in water |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Stock solution 2% (w/v) in water |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Paraformaldehyde 16% in water | Electron Microscopy Sciences | RT 15710-S | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Merck Millipore | 106329 | |
| D(+)-Glucose, Monohydrate | Merck Millipore | 4074-2 | |
| Hydrochloric acid – c(HCl) = 1 mol/l (1 N) Titripur | Merck Millipore | 109057 | |
| Sterile water – Aqua B. Braun | Braun | ||
| Ethanol absolute NORMAPUR analytical reagent | VWR | 20821.321 | |
| Sterile Petri Dishes | VWR | 82050-566 | |
| Pasteur pipettes plain glass – Wilhem Ulbrich GdbR. | VWR | 612-2297 | |
| Counting chamber Malassez | VWR | 631-0975 | |
| Serum Acrodisc Syringe Filter with Supor Membrane, Sterile, GF/0.2 µm, 37 mm | PALL Life science | 4525 | |
| Surgical Scissors – Straight, sharp-sharp, 14.5 cm long | Fine Science Tools | 14002-14 | To open the abdominal wall |
| Scissors – Straight, pointed, delicate, 10 cm long | MORIA | 4877A | To open the uterine wall |
| Forceps – Curved, usual, serrated jaws 1 mm | MORIA | 2183 | To manipulate embryos |
| Vannas Scissors – Curved, pointed, 7 mm blades | MORIA | MC50 | To take out the mesencephalon |
| Ultra Fine Forceps – Curved, delicate, 13 cm long | MORIA | 9987 | To remove meninges |
| BD BioCoat Poly-D-Lysine 24-well Multiwell Plates | BD Bioscience | 356414 | |
| BD Falcon 12-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid | BD Bioscience | 353043 | |
| SuperFrost Microscope Slides, Ground edges 90º | MENZEL-GLÄSER | AG00008032E | |
| Precision cover glasses thickness No. 1.5H circular 18 mm Ø | MARIENFELD | 117580 | |
| Polyclonal Rabbit Anti-Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) Antibody | Chemicon Millipore | AB5622 | 1/200 |
| Monoclonal Mouse Anti-Glutamate Decarboxylase (GAD67) Antibody, clone 1G10.2 | Chemicon Millipore | MAB5406 | 1/400 |
| Monoclonal Rat Anti-Dopamine Transporter (DAT) Antibody, clone DAT-Nt | Chemicon Millipore | MAB369 | 1/500 |
| Monoclonal Mouse Anti-5-HT Antibody | 1/8,000 – Generous gift from Yves Charnay (Swizerland, Yves.Charnay@hcuge.ch) | ||
| Goat Serum, New Zealand Origin | Life Technologies | 16210-064 | |
| Alexa Fluor 405 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-31556 | 1/200 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11001 | 1/1000 |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11007 | 1/1000 |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss microscopy | Stemi-2000C | |
| Bunsen Burner FIREBOY | VWR | 451-0136 |
References
- Glowinski, J., Cheramy, A., Romo, R., Barbeito, L. Presynaptic regulation of dopaminergic transmission in the striatum. Cell Mol Neurobiol. 8, 7-17 (1988).
- Iversen, S. D., Iversen, L. L. Dopamine: 50 years in perspective. Trends Neurosci. 30, 188-193 (2007).
- Dahlstroem, A., Fuxe, K. Evidence for the Existence of Monoamine-Containing Neurons in the Central Nervous System I. Demonstration of Monoamines in the Cell Bodies of Brain Stem Neurons. Acta Physiol Scand Suppl. SUPPL. , 231-255 (1964).
- Chinta, S. J., Andersen, J. K. Dopaminergic neurons. Int J Biochem Cell Biol. 37, 942-946 (2005).
- Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
- Hegarty, S. V., Sullivan, A. M., O’Keeffe, G. W. Midbrain dopaminergic neurons: a review of the molecular circuitry that regulates their development. Dev Biol. 379, 123-138 (2013).
- Samii, A., Nutt, J. G., Ransom, B. R. Parkinson’s disease. Lancet. 363, 1783-1793 (2004).
- Santini, E., Heiman, M., Greengard, P., Valjent, E., Fisone, G. Inhibition of mTOR signaling in Parkinson’s disease prevents L-DOPA-induced dyskinesia. Sci Signal. 2, (2009).
- Ohlin, K. E., et al. Vascular endothelial growth factor is upregulated by L-dopa in the parkinsonian brain: implications for the development of dyskinesia. Brain. 134, 2339-2357 (2011).
- Obeso, J. A., et al. Missing pieces in the Parkinson’s disease puzzle. Nat Med. 16, 653-661 (2010).
- Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson’s disease. Sci Transl Med. 4, (2012).
- Michel, P. P., Toulorge, D., Guerreiro, S., Hirsch, E. C. Specific needs of dopamine neurons for stimulation in order to survive: implication for Parkinson disease. FASEB J. 27, 3414-3423 (2013).
- Decressac, M., Volakakis, N., Bjorklund, A., Perlmann, T. NURR1 in Parkinson disease-from pathogenesis to therapeutic potential. Nat Rev Neurol. , (2013).
- Jouve, L., Salin, P., Melon, C., Le Goff, L. K. e. r. k. e. r. i. a. n. -. Deep brain stimulation of the center median-parafascicular complex of the thalamus has efficient anti-parkinsonian action associated with widespread cellular responses in the basal ganglia network in a rat model of Parkinson’s disease. J Neurosci. 30, 9919-9928 (2010).
- Hirsch, E. C., Jenner, P., Przedborski, S. Pathogenesis of Parkinson’s disease. Mov Disord. 28, 24-30 (2013).
- di Porzio, U., Daguet, M. C., Glowinski, J., Prochiantz, A. Effect of striatal cells on in vitro maturation of mesencephalic dopaminergic neurones grown in serum-free conditions. Nature. 288, 370-373 (1980).
- Denis-Donini, S., Glowinski, J., Prochiantz, A. Glial heterogeneity may define the three-dimensional shape of mouse mesencephalic dopaminergic neurones. Nature. 307, 641-643 (1984).
- Barbin, G., Mallat, M., Prochiantz, A. In vitro studies on the maturation of mesencephalic dopaminergic neurons. Dev Neurosci. 7, 296-307 (1985).
- Marey-Semper, I., Gelman, M., Levi-Strauss, M. A selective toxicity toward cultured mesencephalic dopaminergic neurons is induced by the synergistic effects of energetic metabolism impairment and NMDA receptor activation. J Neurosci. 15, 5912-5918 (1995).
- Salthun-Lassalle, B., Hirsch, E. C., Wolfart, J., Ruberg, M., Michel, P. P. Rescue of mesencephalic dopaminergic neurons in culture by low-level stimulation of voltage-gated sodium channels. J Neurosci. 24, 5922-5930 (2004).
- Toulorge, D., et al. Neuroprotection of midbrain dopamine neurons by nicotine is gated by cytoplasmic Ca2. FASEB J. 25, 2563-2573 (2011).
- Rousseau, E., Michel, P. P., Hirsch, E. C. The Iron-Binding Protein Lactoferrin Protects Vulnerable Dopamine Neurons from Degeneration by Preserving Mitochondrial Calcium Homeostasis. Mol Pharmacol. 84, (2013).
- Orme, R. P., Bhangal, M. S., Fricker, R. A. Calcitriol imparts neuroprotection in vitro to midbrain dopaminergic neurons by upregulating GDNF expression. PLoS One. 8 (e62040), (2013).
- Choi, W. S., Kruse, S. E., Palmiter, R. D., Xia, Z. Mitochondrial complex I inhibition is not required for dopaminergic neuron death induced by rotenone, MPP+, or paraquat. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15136-15141 (2008).
- Trancikova, A., Ramonet, D., Moore, D. J. Genetic mouse models of neurodegenerative diseases. Prog Mol Biol Transl Sci. 100, 419-482 (2011).
- Gao, H. M., Liu, B., Zhang, W., Hong, J. S. Critical role of microglial NADPH oxidase-derived free radicals in the in vitro MPTP model of Parkinson’s disease. FASEB J. 17, 1954-1956 (2003).
- Lin, X., et al. Conditional expression of Parkinson’s disease-related mutant alpha-synuclein in the midbrain dopaminergic neurons causes progressive neurodegeneration and degradation of transcription factor nuclear receptor related 1. J Neurosci. 32, 9248-9264 (2012).
- Bye, C. R., Thompson, L. H., Parish, C. L. Birth dating of midbrain dopamine neurons identifies A9 enriched tissue for transplantation into parkinsonian mice. Exp Neurol. 236, 58-68 (2012).
- Ramonet, D., et al. Dopaminergic neuronal loss, reduced neurite complexity and autophagic abnormalities in transgenic mice expressing G2019S mutant LRRK2. PLoS One. 6 (e18568), (2011).
- Prestoz, L., Jaber, M., Gaillard, A. Dopaminergic axon guidance: which makes what. Front Cell Neurosci. 6, (2012).
- Nunes, I., Tovmasian, L. T., Silva, R. M., Burke, R. E., Goff, S. P. Pitx3 is required for development of substantia nigra dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4245-4250 (1073).
- Ferri, A. L., et al. Foxa1 and Foxa2 regulate multiple phases of midbrain dopaminergic neuron development in a dosage-dependent manner. Development. 134, 2761-2769 (2007).
- Rayport, S., et al. Identified postnatal mesolimbic dopamine neurons in culture: morphology and electrophysiology. J Neurosci. 12, 4264-4280 (1992).
- Kim, K. M., Nakajima, S., Nakajima, Y. Dopamine and GABA receptors in cultured substantia nigra neurons: correlation of electrophysiology and immunocytochemistry. 신경과학. 78, 759-769 (1997).
- Nefzger, C. M., et al. Lmx1a allows context-specific isolation of progenitors of GABAergic or dopaminergic neurons during neural differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells. 30, 1349-1361 (2012).
- Su, H., et al. Immediate expression of Cdh2 is essential for efficient neural differentiation of mouse induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 10, 338-348 (2013).
