Fenotipinin yüksek verim Deneyi<em> Salmonella enterica</em> Typhimurium Derneği, Invasion, ve Makrofagların Çoğaltma
Summary
In vitro olarak fenotip Salmonella veya diğer bakteri federasyonu, invazyon ve yüksek verimlilik kapasitesine sahip fagositik hücreler içerisinde replikasyon için yüksek verimli bir deney geliştirildi. Yöntem konak-patojen etkileşimleri onların tutulumlarla için Salmonella gen nakavt mutant suşlar değerlendirmek için kullanılmıştır.
Abstract
Salmonella türleri zoonotik patojenler ve insanlarda ve hayvancılık 1 gıda kaynaklı hastalıkların önde gelen nedenidir. Salmonella host etkileşimleri altında yatan mekanizmaların anlaşılması, Salmonella enfeksiyonunun moleküler patogenezi aydınlatmak için önemlidir. Gentamisin koruma deneyi yüksek verimli tarama RAW 264.7 kemirgen makrofajlar kullanılarak konak etkileşimleri Salmonella enterica serotip Typhimurium silinmesi mutantların rolleri tanımlamak için izin uyarlanan fagositik hücrelerde Salmonella dernek, işgali ve çoğaltma fenotipik. Bu protokol uyarınca, varyansı vahşi tip ve birden çok mutant suş hem aynı kültürü çanağı içinde ve aynı anda kontrol edilebilir, çünkü ölçümler önemli ölçüde, standart bir protokole göre azalır. Çok kanallı pipetler kullanılması verimi arttırır ve hassasiyet geliştirir. Ayrıca, endişeler daha az ho kullanılmasıyla ilgili96-çukurlu kültür kaplarına oyuk başına ST hücreleri, ele alınmıştır. Burada, fagositik hücreler kullanılarak in vitro olarak modifiye edilmiş Salmonella yayılması deneyinin protokol başarılı bir şekilde ilişkili, invazyon ve hücre içi çoğaltma için 38 birey, Salmonella silme mutantları fenotipik için kullanılmıştır. In vitro fenotipleri bazıları, daha sonra bir hayvan modelinde in vivo fenotiplerini sahip olduğu teyit edilmiştir sunulmuştur. Böylece, modifiye, standardize edilmiş test yüksek verimli kapasiteli bakteriyel-konak etkileşimleri çalışmak için daha geniş yararlanılabilir ile makrofajlar Salmonella dernek, işgali ve çoğaltma fenotipik.
Introduction
Tifoya yol açmayan Salmonella tüm omurgalıların enterik hastalıkların önemli nedenleri vardır. İnsanlarda Salmonella üst bakteriyel gıda kaynaklı hastalıklar 1 arasındadır. Onların hayvan ana Salmonella etkileşimleri destekleyen moleküler mekanizmaların Karakterizasyonu başta enfeksiyon, doku kültürü ve hayvan modellerinde Salmonella enterica serotip Typhimurium (STM) arasında çalışma ile elde edilir. STM-konak etkileşimleri anlayışlar kazanıyor bize Salmonella hayatta ve ev sahibi hücre içindeki büyümeye nasıl anlamanıza yardımcı olacaktır. Bu etkileşimlerin incelenmesinde ilk sorun host ve hem de patojen mümkün olduğunca çok sayıda katılımcı faktörleri belirlemek için, ama bu çabalar büyük ölçüde, aynı anda iki bağımsız karmaşık biyolojik sistemlerle, yani host ve Salmonella uğraşan önemli zorluklar tarafından engellenirse, fizyolojik koşullar altında. Buna ek olarak, büyük repertSalmonella oire ve potansiyel konak etkileşimleri rol faktörleri kodlayan genler konakçı bu meydan mücadele yüksek verim biyolojik platformu gerektirir.
Modifiye, standardize edilmiş test olasılıkla Salmonella -host etkileşimleri çekici genlerin büyük bir set incelemek için geliştirilmiştir yüksek verimlilik kapasitesi ile makrofajlar Salmonella dernek, işgali ve çoğaltma fenotipik. Gentamisin koruma deneyi 1973 2 yılında geliştirilen, ama önce iyice 1994 yılında 3,4 Elsinghorst tarafından tarif edilmiştir. Şimdi Salmonella 5,6 olmak üzere, ex vivo birçok hücre içi bakteriyel patojenler, eğitim için standart bir araç haline gelmiştir. Içselleştirilmiş bakteriler ökaryot hücrelerin 3 nüfuz edemez Gentamisın gibi bazı antibiyotikler, tarafından öldürülüyor kaçınırım. Bu fenomenin avantajlarından yararlanarak, Gentamisin koruma deneyi hücre içi ba hayatta kalma ve büyüme ölçercterial bir patojen görülmüyordu. Enfeksiyon sırasında üç olay, yani ökaryotik hücreler, invazyon ve çoğaltma ile işbirliği içinde, enfeksiyon, Gentamisin tedavisi ve tekrar enkübe edildikten (Şekil 1) arasındaki zaman aralığına bağlı olarak hücre içi bakteriyel patojenler için değerlendirilebilir. Ökaryotik hücre hatları konak-patojen etkileşimi çalışmaları için ilgili hayvan modellerinde daha az karmaşık bir fizyolojik ortam sağlar.
Gentamisin koruma deneyi STM konakçı etkileşimleri incelemek için uygun bir platform, ama 24-yuvalı kültür kaplarına bir şekilde standart analiz düşük verimlilik kapasitesine sahiptir. In vivo veri setleri Hesaplamalı analiz yaklaşık 300 konak gen ürünlerinin (yayınlanmamış veri) ile etkileşim tahmin edilmektedir 149 Salmonella gen ürünlerini belirledi. Standart Gentamisin koruma deneyi verimli mutantlar bu sayı fenotipik kapasiteye sahip değildir.
Additiyon, Gentamisin koruma deneyi teorik hatta tek bir bakterinin işgali algılayabilir. Farklı zamanlarda tekrar geldiğinde çünkü bu doğal duyarlılık için ham veriler, teknik varyansları duyarlıdırlar. Iç kontrol ve normalleştirme sonrası göreli veri sunumu sonuçlarının anlamlı yorumlanması için gereklidir. Bu hususlar dikkate alındığında, modifiye, standardize Gentamisin koruma deneyi test kapasitesini geliştirmek ve hassasiyetini artırmak için geliştirilmiştir.
Aşağıdaki protokol, detaylı ve 96 bölümlü kültür tabaklarına ve sıçangil makrofaj hücre çizgisi RAW264.7 kullanarak değiştirilmiş Gentamisin koruma deneyi gerçekleştirmek için resimli. 24-Kaynak kültür tabağı içindeki standart bir protokole göre, değiştirilmiş bir protokol, aşağıdaki avantajlara sahiptir: 1) 96-yuvalı kültür kaplarına kullanılması yeterli istatistiksel güç dahili pozitif ve negatif kontroller de dahil olmak üzere fenotiplenebilmektedir 10 farklı mutant suşları kadar izin verir;Mutant soylar olarak aynı kültür çanağı ve aynı zamanda test edilmiştir, çünkü 2) sonuç varyans önemli ölçüde azalır; Operatör yorgunluğunu azaltırken 3) çok kanallı pipetler kullanılması verimini arttırır. Son olarak, 24-çukurlu kültür tabaklarında karşılaştırarak, 96-çukurlu kültür kaplarına oyuk başına daha az konak hücre kabul protokol optimizasyonu ve standardizasyonu ile ele alınmıştır.
Özetle, fagositik hücrelerde in vitro fenotip Salmonella ve diğer bakteriyel dernek, işgali ve çoğaltma değiştirilmiş, standardize edilmiş test hassasiyeti artar ve operatörün yorgunluğunu azaltırken yüksek verim kapasitesine ulaşır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gentamisin koruma deneyi yaygın konakçı hücre içinde hücre içi bakteriyel patojenler işgali ve çoğaltma incelemek için kullanılır ve özellikle kimin işgali enfeksiyonu 1 kurulması için önkoşul adımdır Salmonella gibi patojenlerin eğitim için önemli bir biyolojik aracıdır. Salmonella araştırma camiasında standart Gentamisin koruma deneyi 24-kuyu kültür çanak 5 uygulanmaktadır. 48 ya da 96 oyuklu plakaların kullanımı, yüksek verimlilik kapasitesi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu proje (AJB ve LGA, R01 AI076246 için) Sağlık NIAID National Institutes için bir hibe ile kısmen desteklenmiştir. Salmonella mutant koleksiyonu kısmen Ulusal Sağlık hibe Enstitüleri (MM için, U01 A152237-05, R01 AI07397-01, R01 ve R01 AI039557-11 AI075093-01) HKP, R21 kısmen Sağlık hibe Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından, (tarafından desteklenen AI083964-01, 1R0 1AI083646-01, 1R56AI077645, R01 AI075093). Biz kopya kaplama ve koleksiyonunda mutantlar teyit için Steffen Prowollik teşekkür ederim.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965 | |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30910.03 | |
| T-75 cell culture flask vented filter cap | Nest Biotechnology | 708003 | |
| 100X Non-Essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
| Cell scraper | BD Falcon | 353086 | |
| 96-well cell culture plate | Corning Incorporated | 3595 | |
| Luria-Bertani (LB) broth | MP Biomedicals | 3002-075 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | BD Falcon | 352059 | |
| PBS pH7.4 (1x) | Life Technologies | 10010 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Kanamycin solution | Sigma | K0254 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1272 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 |
References
- Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. Salmonellae interplay with host cells. Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).
- Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. The Journal of clinical investigation. 52, 1673-1679 (1973).
- Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods Enzymol. 236, 405-420 (1994).
- Elsinghorst, E. A., Weitz, J. A. Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic Escherichia coli tib locus is associated with a 104-kilodalton outer membrane protein. Infect Immun. 62, 3463-3471 (1994).
- Behlau, I., Miller, S. I. A PhoP-repressed gene promotes Salmonella typhimurium invasion of epithelial cells. J Bacteriol. 175, 4475-4484 (1993).
- Hueck, C. J., et al. Salmonella typhimurium secreted invasion determinants are homologous to Shigella Ipa proteins. Mol Microbiol. 18, 479-490 (1995).
- Steele-Mortimer, O. Infection of epithelial cells with Salmonella enterica. Methods Mol Biol. 431, 201-211 (2008).
- Foster, J. W., Spector, M. P. How Salmonella survive against the odds. Annu Rev Microbiol. 49, 145-174 (1995).
- Edwards, A. M., Massey, R. C. Invasion of human cells by a bacterial pathogen. Journal of visualized experiments JoVE. 10, (2011).
- Molinari, G., et al. The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells. Mol Microbiol. 40, 99-114 (2001).
- Van der Velden, A. W., Lindgren, S. W., Worley, M. J., Heffron, F. Salmonella pathogenicity island 1-independent induction of apoptosis in infected macrophages by Salmonella enterica serotype typhimurium. Infect Immun. 68, 5702-5709 (2000).
- Santos, R. L., Zhang, S., Tsolis, R. M., Baumler, A. J., Adams, L. G. Morphologic and molecular characterization of Salmonella typhimurium infection in neonatal calves. Vet Pathol. 39, 200-215 (2002).
- Lawhon, S. D., et al. Role of SPI-1 secreted effectors in acute bovine response to Salmonella enterica Serovar Typhimurium a systems biology analysis approach. PLoS One. 6, e26869 (2011).
- Drecktrah, D., Knodler, L. A., Galbraith, K., Steele-Mortimer, O. The Salmonella SPI1 effector SopB stimulates nitric oxide production long after invasion. Cell Microbiol. 7, 105-113 (2005).
