Hochdurchsatz-Assay zum Phänotyp<em> Salmonella enterica</em> Typhimurium Association, Invasion und Replikation in Makrophagen
Summary
Eine Hochdurchsatz-Assay in vitro Phänotyp Salmonellen oder andere bakterielle Verein, Invasion und Replikation in Fresszellen mit hoher Durchsatzleistung entwickelt. Die Methode wurde eingesetzt, um Salmonellen Gen-Knockout-Mutanten-Stämme für ihre Verstrickungen in der Wirt-Pathogen-Interaktionen zu bewerten.
Abstract
Salmonella-Arten sind Zoonoseerreger und führenden Ursachen von lebensmittelbedingten Krankheiten bei Mensch und Vieh 1. Das Verständnis der Mechanismen Salmonellen -host Interaktionen zugrunde liegen, sind wichtig, um die molekularen Pathogenese der Salmonellen-Infektion aufzuklären. Die Gentamicin-Schutztest auf Salmonellen Verein, Invasion und Replikation in Fresszellen Phänotyp angepasst, damit Hochdurchsatz-Screening, um die Rollen der Deletionsmutanten von Salmonella enterica Serotyp Typhimurium in Wirt-Interaktionen mit RAW 264.7 Makrophagen Maus definieren. Unter diesem Protokoll, die Varianz bei Messungen, verglichen mit dem Standardprotokoll erheblich reduziert, da Wildtyp-und Mutantenstämmen mehrere in der gleichen Kulturschale und gleichzeitig getestet werden. Die Verwendung von Mehrkanalpipetten erhöht den Durchsatz und erhöht die Präzision. Darüber hinaus betrifft die Verwendung weniger ho bezogenenST-Zellen pro Well in 96-Well-Kulturschale angesprochen. Hier wurde das Protokoll des modifizierten in vitro-Assay mit Salmonella Invasion Fresszellen erfolgreich eingesetzt, um 38 Einzel Salmonellen Deletionsmutanten für Verein, Invasion und intrazellulären Replikationsphenotyp. Die in vitro-Phänotypen vorgestellt, von denen einige später bestätigt Phänotypen in vivo in einem Tiermodell zu haben. So wird die modifizierte, standardisierte Test mit Salmonellen Verein, Invasion und Replikation in Makrophagen, die mit Hochdurchsatzleistung konnte im weiteren Sinne verwendet, um Bakterien-Wirt-Interaktionen zu untersuchen Phänotyp.
Introduction
Nontyphoidal Salmonellen sind wichtige Ursachen von Darmerkrankungen in allen Wirbeltieren. Salmonellose beim Menschen ist unter den Top bakterielle lebensmittelbedingten Erkrankungen ein. Charakterisierung der molekularen Mechanismen, die die Wechselwirkungen von Salmonella mit ihrer tierischen Wirte unterstützen wird hauptsächlich durch die Untersuchung von Salmonella enterica-Serotyp typhimurium (STM) in der Gewebekultur und Tiermodellen der Infektion erreicht. Einblicke in STM-Wirt-Interaktionen wird uns helfen, zu verstehen, wie Salmonellen überleben und wachsen in Wirtszellen. Die erste Herausforderung bei der Untersuchung dieser Wechselwirkungen ist, so viele teilnehmende Faktoren wie möglich von beiden Wirt und Pathogen zu identifizieren, aber diese Bemühungen sind weitgehend durch den erheblichen Schwierigkeiten im Umgang mit zwei unabhängigen komplexen biologischen Systemen gleichzeitig, dh, Host-und Salmonella behindert, unter physiologischen Bedingungen. Zusätzlich ist die große repertOire von Salmonella und Wirtsgene möglicherweise Faktoren in Wirt-Interaktionen beteiligt Codierung erfordern Hochdurchsatz-biologische Plattform, um diese Herausforderung zu bewältigen.
Eine modifizierte, standardisierte Test mit Salmonellen Verein, Invasion und Replikation in Makrophagen, die mit Hochdurchsatzkapazität Phänotyp wurde entwickelt, um eine große Gruppe von Genen wahrscheinlich Beteiligung an Salmonellen -host Wechselwirkungen zu untersuchen. Die Gentamicin-Schutz-Assay wurde im Jahr 1973 2 entwickelt, wurde aber zunächst gründlich von Elsinghorst 1994 3,4 beschrieben. Es wurde nun ein Standard-Werkzeug für die Untersuchung viele intrazelluläre bakterielle Erreger ex vivo, einschließlich Salmonellen 5,6 geworden. Verinnerlicht Bakterien zu vermeiden, die von einigen Antibiotika, wie Gentamicin, die nicht eukaryotischen Zellen eindringen kann 3 getötet. Durch Ausnutzung dieses Phänomens, misst die Gentamicin-Schutz-Assay, das Überleben und das Wachstum von intrazellulären bacterial Krankheitserreger. Drei Ereignisse, die während der Infektion, das heißt zusammen mit eukaryotischen Zellen, Invasion und Replikation können für die intrazelluläre bakterielle Pathogene auf der Basis des Zeitintervalls zwischen der Infektion, Gentamicin-Behandlung und eine weitere Inkubation (1) ausgewertet werden. Eukaryotische Zelllinien eine physiologische Umgebung, die weniger komplex als relevanten Tiermodellen für Wirt-Pathogen-Interaktionsstudien ist.
Die Gentamicin-Schutz-Assay ist eine geeignete Plattform, um STM-Wirt-Interaktionen zu studieren, aber die Standard-Assay in einer 24-Well-Kulturschale hat eine geringe Durchsatzkapazität. Computergestützte Analyse in vivo Datensätze identifiziert 149 Salmonella-Genprodukte, die voraussichtlich mit rund 300 Gast Genprodukte (unveröffentlichte Daten) zu interagieren. Die Standard-Gentamicin-Schutztest hat nicht die Fähigkeit, diese Anzahl von Mutanten effizient Phänotyp.
In additIonen, die Gentamicin-Schutz-Assay kann theoretisch die Invasion auch nur eines einzigen Bakterium erkennen. Wegen dieser inhärenten Empfindlichkeit sind die Rohdaten anfällig für technische Abweichungen, wenn zu verschiedenen Zeitpunkten wiederholt. Die internen Kontrollen und die relative Darstellung der Daten nach der Normalisierung sind für sinnvolle Interpretation der Ergebnisse. Angesichts dieser Überlegungen wurde eine modifizierte, standardisierte Gentamicin Protection Assay entwickelt, um Testkapazität erhöhen und die Präzision.
Das folgende Protokoll ist eine detaillierte und illustrierte, um die geänderte Gentamicin-Schutz-Assay unter Verwendung von 96-Well-Kulturschalen und die murine Makrophagen-Zelllinie RAW264.7 durchzuführen. Im Vergleich zur Standard-Protokoll in 24-Well-Kulturschalen hat die modifizierte Protokoll die folgenden Vorteile: 1) unter Verwendung von 96-Well-Kulturschalen können bis zu 10 verschiedene Mutantenstämme phänotypisiert werden einschließlich der internen positiven und negativen Kontrollen mit ausreichender statistischer Power;2) Die Varianz der Ergebnisse wird deutlich reduziert, da die Mutantenstämme sind in der gleichen Kulturschale und zur gleichen Zeit getestet; 3) Die Verwendung von Mehrkanalpipetten erhöht den Durchsatz und reduziert Ermüdungserscheinungen. Schließlich Vergleich zu 24-Well-Kulturschalen wurden Bedenken von weniger Wirtszellen pro Well in 96-Well-Kulturschale durch Protokolloptimierung und Standardisierung gerichtet.
Zusammenfassend ist die modifizierte, standardisierte Test zur in-vitro-Phänotyp Salmonellen oder andere bakterielle Verein, Invasion und Replikation in Fresszellen erhöht die Präzision und erreicht Hochdurchsatzleistung bei gleichzeitiger Reduzierung Ermüdung des Bedieners.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Gentamicin-Schutztest wird häufig eingesetzt, um das Eindringen und die Vermehrung von intrazellulären bakteriellen Krankheitserregern im Wirtszelle zu untersuchen, und es ist insbesondere ein wichtiges Werkzeug für die Untersuchung biologischer Pathogene wie Salmonellen, deren Einfall ist die Voraussetzung für die Festlegung Schritt 1 Infektion. Die Standard-Gentamicin-Schutztest bei Salmonella-Forschung wird in 24-Well-Kulturschale 5 implementiert. Obwohl die Verwendung …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Projekt wurde teilweise durch einen Zuschuss für National Institutes of Health NIAID (für AJB und LGA, R01 AI076246) unterstützt. Die Salmonella-Mutante Sammlung wurde teilweise von der National Institutes of Health Zuschüsse (für MM, U01 A152237-05, R01 AI07397-01, R01 und R01 AI039557-11 AI075093-01), teilweise von der National Institutes of Health Zuschüsse (für HAP, R21 unterstützt AI083964-01, 1R0 1AI083646-01, 1R56AI077645, R01 AI075093). Wir danken Steffen Prowollik für Replikaplattierung und Bestätigung der Mutanten in der Sammlung.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965 | |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30910.03 | |
| T-75 cell culture flask vented filter cap | Nest Biotechnology | 708003 | |
| 100X Non-Essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
| Cell scraper | BD Falcon | 353086 | |
| 96-well cell culture plate | Corning Incorporated | 3595 | |
| Luria-Bertani (LB) broth | MP Biomedicals | 3002-075 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | BD Falcon | 352059 | |
| PBS pH7.4 (1x) | Life Technologies | 10010 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Kanamycin solution | Sigma | K0254 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1272 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 |
References
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