Avaliando a capacidade de secreção de pâncreas Acinar Células

Summary

Isolados ácinos pancreáticos manter a sua morfologia in vivo e atividade e oferecer maneiras poderosas para a monitoração e manipulação de secreção. Este trabalho demonstra como ácinos pode ser isolada a partir do pâncreas do rato, e como as suas capacidades de secreção pode ser avaliada.

Abstract

Células acinares do pâncreas produzir e secretar enzimas digestivas. Estas células são organizadas como um conjunto que forma e partilha uma luz comum. Este trabalho demonstra como a capacidade de secreção dessas células pode ser avaliada por cultura de isolado ácinos. A configuração é vantajosa, uma vez ácinos isolado, que retêm muitas das características do pâncreas exócrino intacto pode ser manipulado e monitorizado mais facilmente do que em todo o animal. Isolamento adequado dos ácinos pancreáticos é um requisito essencial para que a cultura ex vivo irá representar a natureza in vivo dos ácinos. O protocolo demonstra como isolar intacta ácinos do pâncreas do rato. Posteriormente, dois métodos complementares para avaliar a secreção pancreática são apresentados. O ensaio de secreção de amilase serve como uma medida global, enquanto a imagem directa da secreção pancreática permite a caracterização de secreção com uma resolução sub-celular. Coletivamente, as técnicas presented aqui possibilitar um largo espectro de experiências para estudar a secreção exócrina.

Introduction

O pâncreas exócrino constitui a maior parte da massa do pâncreas dos mamíferos e é dedicado à produção e secreção de enzimas digestivas ^1. A unidade funcional do pâncreas exócrino, o ácino, é um aglomerado de células epiteliais que formam partes e um lúmen conjunta. Após a estimulação hormonal ou neuronal, as vesículas cheias com enzimas são transportados para a superfície celular apical, fusível com ele e expelir o seu conteúdo para dentro do lúmen ^1-3. As enzimas secretadas são, em seguida, drenada por um conjunto de condutas de coalescência para o intestino delgado, onde eles catalisam a quebra dos alimentos em nutrientes.

Este vídeo demonstra como ácinos intactos são isolados a partir de todo o pâncreas, e como a sua capacidade de secreção pode ser avaliada. Usando esta configuração, a secreção pancreática é quantificada através da medição da quantidade relativa de amilase que foi lançado após a estimulação. Alternativamente, a secreção pode ser trabalhada ao vivo através da utilização de diferentessensores e corantes.

A configuração ex vivo de ácinos pancreáticos é vantajoso uma vez que ácinos isolado, que retêm muitas das características dos pâncreas intacto, pode ser manipulado mais facilmente e monitorizados em que o animal inteiro ^4-6. Esta configuração foi originalmente desenvolvido no final dos anos 1970 e foi estendido desde para o estudo de vários tecidos exócrinas, como a saliva e glândulas mamárias ^3-7. Notavelmente, que permite o estudo da secreção com uma interferência mínima com as organizações celulares complexos destes epitélios polarizados.

Protocol

NOTA: Os procedimentos que envolvem seres animais foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional (IACUC) no Instituto de Ciência Weizmann. Preparação 1 Amostra Isolamento de ácinos pancreáticos Prepare 300 ml de doce de bicarbonato de Krebs-Ringer HEPES (KRBH) médio antes de começar. Misturar NaCl 140 mM, KCl 4,7 mM, 1,16 mM de MgCl2, 1 mM de CaCl2, 11 mM de glucose, 10 mM de HEPES. Adicionar a albumina de soro bovino (BSA)…

Representative Results

Ácinos do pâncreas que foram isolados correctamente exibir uma morfologia estereotipado quando vistas pela luz transmitida. Seus domínios basolateral deve aparecer redonda e sem bolhas. O domínio apical é rodeado por centenas de vesículas secretoras e aparecer de cor mais escura (Figura 2A, B). Os núcleos estão localizados basal para a área vesicular. Detritos e componentes do sistema ductal pancreático e do pâncreas endócrino, que pode ser detectada nos primeiros estádios de isolamento ác…

Discussion

Além disso a cultura ex vivo, configurações alternativas para o estudo da secreção exócrina incluem microscopia intravital e medição de fluidos do ducto pancreático. Microscopia intravital foi mostrado para operar bem na rato glândulas salivares ^10. Este método pode gravar a secreção em tempo real no animal intacto, mas é limitada na sua resolução e por os meios para a manipulação do tecido exócrino. Avaliando a secreção através da recolha de fluidos do ducto pancreático foi co…

Materials

ICR mice	Harlan		Any strain will do
HBSS	Sigma Aldrich	H8264	Can substitude for KRB
BSA	Sigma Aldrich	A7906	Fraction V
Trypsin inhibitor	Sigma Aldrich	T9003
Collagenase XI	Sigma Aldrich	C0130
Nylon mesh	BD Falcon	352360	70-100µm
Amylase infinity reagent	Thermo	TR25421
CCK	Sigma Aldrich	C2175
FM4-64	Lifetechnologies	F34653	Diluted to 16µM
20mL scintillation vial	Sigma Aldrich	Z190527
DeltaVision system	Applied Precision		Consisting of an inverted microscope IX71 equipped with 60x/1.4 or 100x/1.3 objectives (Olympus)
Zeiss 510 or 710 confocal microscope	Zeiss		60x/1.4 or 100x/1.4 objectives
Ultra Microplate reader	BioTek	ELx808