Vurdering af Sekretorisk Kapacitet bugspytkirtlen acinusceller

Summary

Isolerede pancreas acini bevarer deres in vivo morfologi og aktivitet og tilbyde effektive måder til at overvåge og manipulere sekretion. Dette arbejde viser, hvordan acini kan isoleres fra muse-bugspytkirtlen, og hvordan deres sekretoriske kapacitet kan vurderes.

Abstract

Pancreas acinære celler producerer og udskiller fordøjelsesenzymer. Disse celler er organiseret som en klynge, der danner og deler en fælles lumen. Dette arbejde viser, hvordan sekretorisk kapacitet af disse celler kan vurderes ved dyrkning af isolerede acini. Opsætningen er en fordel, da isolerede acini, som bevarer mange egenskaber intakte exokrin bugspytkirtlen kan manipuleres og overvåges lettere end i hele dyret. Korrekt isolering af pancreas acini er et centralt krav, således at ex vivo kultur vil repræsentere in vivo natur acini. Protokollen viser, hvordan man isolere intakt acini fra muse bugspytkirtlen. Efterfølgende to komplementære metoder til evaluering pancreassekretion fremlagt. Den amylasesekretion analysen fungerer som et globalt mål, mens direkte billeddannelse af pancreassekretion tillader karakterisering af sekretion ved en sub-cellulær opløsning. Kollektivt, de teknikker Presented her muliggøre et bredt spektrum af forsøg for at studere eksokrine sekretion.

Introduction

Den exokrine pancreas udgør det meste af massen af pattedyr bugspytkirtel og er dedikeret til produktion og sekretion af fordøjelsesenzymer ^1. Den funktionelle enhed af eksokrine bugspytkirtlen, acinus, er en klynge af epitelceller, som danner og deler en fælles lumen. Ved hormonal og neuronal stimulation er vesikler fyldt med enzymer, transporteres til den apikale celleoverfladen, sikring med det og uddrive deres indhold ind i hulrummet ^1-3. De udskilte enzymer derefter drænes af sammensmeltende sæt af kanaler i tyndtarmen, hvor de katalyserer nedbrydningen af ​​fødevarer i næringsstoffer.

Denne video viser, hvordan intakt acini isoleres fra hele bugspytkirtlen, og hvordan deres sekretorisk kapacitet kan vurderes. Ved hjælp af denne opsætning er pancreassekretion kvantificeres ved at måle den relative mængde amylase, der blev udgivet efter stimulering. Alternativt kan sekretion skal afbildes direkte ved anvendelse af forskelligesensorer og farvestoffer.

Ex vivo opsætning af pancreas-acini er fordelagtig, eftersom isoleret acini, som bevarer mange karakteristika af de intakte bugspytkirtlen, kan manipuleres og overvåges lettere end i hele dyret ^4-6. Denne opsætning blev oprindelig udviklet i slutningen af 1970'erne og var siden forlænget til undersøgelse af flere exokrine væv, såsom spyt og mælkekirtler ^3-7. Især det giver studiet af sekretion med minimal indblanding på de komplekse cellulære organisationer i disse polariserede epithel.

Protocol

BEMÆRK: procedurer, der involverer dyreindivider er blevet godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) ved Weizmann Institute of Science. 1. Prøvefremstilling Isolering af pancreas acini Forbered 300 ml frisk Krebs-Ringer bicarbonat HEPES (KRBH), før du begynder. Bland 140 mM NaCI, 4,7 mM KCI, 1,16 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 11 mM glucose, 10 mM HEPES. Tilføj bovint serumalbumin (BSA) og 0,1 mg / ml sojabønnetrypsininhibitor (STI) (r…

Representative Results

Pancreas acini der blev isoleret ordentligt vise en stereotyp morfologi, når de ses ved gennemlysning. Deres basolaterale domæner skal vises rundt og blottet for bleb'er. Den apikale domæne er omgivet af hundredvis af sekretoriske vesikler og synes mørkere i farven (figur 2A, B). Kernerne placeret basal til vesikulær område. Cellerester og komponenter i pancreas gangsystemet og endokrine bugspytkirtlen, som kan detekteres ved tidlige stadier af acini isolering (figur 2C, D) b?…

Discussion

Udover ex vivo kultur, alternative opstillinger til studiet af eksokrine sekretion omfatter intravital mikroskopi og måling af væsker fra pankreasgangen. Intravital mikroskopi blev vist sig at fungere godt i mus spytkirtler ^10. Denne metode kan optage sekretion i realtid i det intakte dyr, men er begrænset i sin beslutning og midlerne til at manipulere exokrine væv. Vurdering sekretion ved at samle fluider fra pankreasgangen blev opnået i bedøvede rotter ^11. Men da kanylering af pank…

Materials

ICR mice	Harlan		Any strain will do
HBSS	Sigma Aldrich	H8264	Can substitude for KRB
BSA	Sigma Aldrich	A7906	Fraction V
Trypsin inhibitor	Sigma Aldrich	T9003
Collagenase XI	Sigma Aldrich	C0130
Nylon mesh	BD Falcon	352360	70-100µm
Amylase infinity reagent	Thermo	TR25421
CCK	Sigma Aldrich	C2175
FM4-64	Lifetechnologies	F34653	Diluted to 16µM
20mL scintillation vial	Sigma Aldrich	Z190527
DeltaVision system	Applied Precision		Consisting of an inverted microscope IX71 equipped with 60x/1.4 or 100x/1.3 objectives (Olympus)
Zeiss 510 or 710 confocal microscope	Zeiss		60x/1.4 or 100x/1.4 objectives
Ultra Microplate reader	BioTek	ELx808