フローサイトメトリーによる腎上皮細胞における細胞質ゾルカルシウム測定

Summary

カルシウムは、多くの生理学的および病態生理学的なシグナル伝達経路に関与している。生細胞イメージングは​​、特殊な設備を必要とし、時間がかかる可能性がある。懸濁液中に持ち込ま付着上皮細胞における細胞質カルシウムの相対的変化を決定するために、フローサイトメーターを使用して迅速に、簡単な方法を最適化した。

Abstract

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Introduction

カルシウムは、細胞の生理学的および病態生理学的信号¹の送信を担当する重要なセカンドメッセンジャーである。細胞質カルシウム濃度は、カルシウムポンプとカルシウム交換体の活性を介して低く保たれている。筋小胞体/小胞体カルシウムATPアーゼ（SERCA）のATP依存様式で両方の、原形質膜カルシウムATPアーゼ（PMCA）は、細胞外区画へのカルシウムを押し出す一方で「ポンプリーク」システムの一部として、小胞体（ER）カルシウムストアを補充^2。そのようなホルモンや神経伝達物質などの生理的メッセンジャーは、Gタンパク質共役受容体、ジアシルグリセロールおよびイノシトール三リン酸^{（IP3）3を}生成するために、原形質膜にホスファチジルイノシトール4,5-ビスリ ​​ン酸（PIP2）を加水分解するホスホリパーゼCの活性化を介してそれらの信号を送信する。ジアシルグリセロールは、原形質膜に残っている間、IP3は、細胞質ゾル中に拡散し、IP3受容体に結合するER膜とカルシウムで見られるリガンドカルシウムチャネルを活性化する複数（IP3Rs）は、細胞質カルシウム濃度の増加は⁴で最高潮に達するER腔ストアから放出される。細胞質ゾルに到達するカルシウムのための代替経路は、原形質膜に存在するカルシウムチャンネルと交換によるものである。これら二つの区画間のクロストークが記載されている：カルシウム誘導性カルシウム外カルシウムがER店⁵からのカルシウム放出を誘導放出（CICR）、およびストアはSTIMによって感知されるERストアを空にするカルシウム流入（SOCE）を操作して往来の開口を引き起こす原形質膜カルシウムチャネルは、ER店舗⁶の補充を促進する。

病態生理学的条件下では、細胞のカルシウム応答は、生理的刺激物質¹の非存在下での脱制御および細胞質のカルシウムが増加する。カルシウム応答は、多くの方法で影響を受ける可能性がある：カルシウム長期信号、細胞質ゾルからのカルシウム除去、カルシウム貯蔵またはカルシウムの局所的変化の枯渇を遅らせた。さらに、ミトコンドリアは、バッファリングで中心的な役割を引き受けるとカルシウム^7をリリース。延長および/または過最大細胞質カルシウムの増加は、細胞死に至る。実際に、カルシウムがより頻繁な細胞の病態生理学的応答に関与する主な細胞死と関連しているような神経変性疾患、心臓病、癌、骨疾患および腎疾患などの疾患の幅広い、における重要な事象ではないよりもおよび臓器または組織機能^8-10の損失または変更。また、カルシウムシグナルの摂動は、細胞の適応及び細胞機能および応答の変化に関連している。

伝統的には、カルシウムシグナルを細胞透過性アセトキシメチル（AM）エステルの形で細胞内にロードされた負に帯電した蛍光カルシウム指示薬を用いて測定される。かつて携帯esterasにより開裂ES、蛍光指示薬は、細胞内コンパートメント内に残るとカルシウムが結合した時に蛍光強度の増加。最もよく知られており、カルシウム指示薬を使用レシオメトリックのFura-2ロジャーツィンと同僚¹¹によって開発されています。カルシウムに対する異なる親和性カルシウム指示薬は異なるカルシウムプールを監視することを可能にする。検出方法は、生細胞イメージング、蛍光マイクロプレートリーダー、フローサイトメトリーが含まれる。 （通常、数分〜数秒以内）カルシウムシグナルの比較的速い反応速度は、カルシウムシグナルの特性に関する大部分の情報を得るための最善の方法を画像化する生細胞を作る。別に（ミリ秒以内）カルシウムシグナルの速い反応速度から、生細胞イメージングは、単一のセル¹²内のカルシウムシグナル伝達の細胞内区画化を研究するための優れた方法である。絶対的なカルシウム濃度は、カルシウムのindの最小および最大蛍光を測定することによって計算することができるGrynkiewicz ら ¹¹によって記載されているように、それぞれ、カルシウムキレート剤を添加して細胞を透過性にすることによってicator。

カルシウムシグナルを測定するフローサイトメトリーの使用は、最初の機会は、膜の完全性および分離細胞集団の、単一波長の開発と組み合わせ懸濁液中の細胞の必要性などの複数のパラメータを測定するための免疫学的細胞中で1980年代に開発されたカルシウム指標は理想とconvenientdetection方法^13-15たフローサイトメトリーを作った。付着細胞では、生細胞イメージングは​​、カルシウムシグナル伝達、最も重要な動力学に関するほとんどの情報を提供するが、取得するための温度等の蛍光顕微鏡、灌流システム、細胞環境の維持を含む複雑な設定、および特殊な顕微鏡ソフトウェアが必要データを分析する。そのような蛍光マイクロプレートリーダーまたはpharmacolなどの代替方法カルシウムキレート剤の使用によるogical手段は、得られた情報の点で比類のないです。フローサイトメトリーの研究の大部分においてのみ、エンドポイントの測定が行われ、より広くも付着細胞における細胞質カルシウムを監視するために使用されるようになっている。最初にはGergely らによって開発された方法を用いて製造した。免疫学的B細胞¹⁶に、サンプル集団の個々の細胞の蛍光強度をモニターするリアルタイム動態を用いたフローサイトメトリーによる細胞質ゾルの遊離カルシウム濃度の変化および正常癌上皮細胞で測定されているそして癌は細胞ハイブリッド^17幹 。この方法は、さらにカルシウム指示薬¹⁸とロードすることが困難であり、付着上皮細胞での使用に適合した。

ここでは、ラット腎臓近位尿細管（WKPT-0293 ^Cl.2）19のS1セグメントに由来する不死化接着性上皮細胞株を使用して、我々は、最適化を簡略化メートルを記述フローサイトメトリーによる細胞質カルシウム濃度の変化を測定するためのethod。多くの上皮細胞は、アニオン性化合物のための有機トランスポーターの数を有しているので、カルシウム指示薬を用いた細胞のローディングは挑戦であることを証明することができます。カルシウム指示薬、プロベネシド、ペニシリン²⁰の腎排泄を減少させるために開発された当初は原型的有機アニオントランスポーターの阻害剤との流出を防ぐために、インキュベーション培地に同時に印加される。細胞は、カルシウム指示薬をロードするための単層で維持化合物添加直後に検出することができるサスペンションカルシウム信号にされる。

Protocol

試薬およびソリューションの調製修正されたハンクス平衡塩溶液（HBSS）の準備（単位：mm：136.9のNaCl、5.37のKCl、0.34のNa 2 HPO 4、0.44 KH 2 PO 4、4.17のNaHCO 3、pHは7.2、無フェノールレッド）。 4℃で保存。 1.5 M CaCl 2および2 M 4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）（pH7.2）中で蒸留水を用いてストック溶液を?…

Representative Results

細胞質カルシウムを増加させるために、2薬理学的化合物は、細胞透過性カルシウム結合色素、フルオ-3-AMを負荷し、腎近位尿細管細胞（WKPT-0293 Cl.2）に適用した。未処理の対照試料は、プロベネシドの存在下でのカルシウム結合色素を負荷し、混合したが、任意の化合物を添加せずに行った。タプシガルギン（TG）は、ERからの漏れにつながると細胞質カルシウムの増加をもたらすSERCAポンプ?…

Discussion

カルシウムは、セカンドメッセンジャーシグナル伝達分子として、また、ERおよびミトコンドリアの間で通信するための手段として、複数の細胞プロセスにおいて重要な事象である。自由な細胞質カルシウム濃度の変化を測定する能力は、細胞生物学のすべての領域に適用することができる有用な技術である。細胞質ゾルのカルシウムシグナルを検出するための様々な方法がある。古典的に?…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Fluo-3, AM	Invitrogen	F-1241	Cell permeable
Probenecid	Sigma-Aldrich	P-8761	Water insoluble, dissolve in 1 N NaOH
0.05% Trypsin-EDTA (1X)	Invitrogen	25300-062
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I9657
Thapsigargin	Tocris Bioscience	1138
Tunicamycin	Sigma-Aldrich	T7765
FACSCalibur Flow Cytometer + CELLQuest software	Becton Dickinson
Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI)	Joe Trotter, The Scripps Institute		Please note that this is an older 16-bit application that reads FCS 2.0 compliant files but does not recognize FCS 3.0 digital data.
WKPT-0293 Cl.2 rat kidney proximal tubule cell line			Made available by Dr. Ulrich Hopfer (Department of Physiology & Biophysics, Case Western Reserve University, Cleveland, OH)