Riktlinjer presenteras för generering av mördaren artificiella antigenpresenterande celler, KaAPC, ett effektivt verktyg för in vitro utarmning av humana antigenspecifika T-celler och en alternativ lösning på cellulär immunterapi för behandling av T-cellsmedierade autoimmuna sjukdomar i en antigen specifikt sätt utan att kompromissa med de återstående immunsystem.
Nuvarande behandling av T-cellsmedierade autoimmuna sjukdomar bygger mestadels på strategier för global immunsuppression, vilket på lång sikt, åtföljs av negativa biverkningar, såsom en minskad förmåga att kontrollera infektioner eller maligniteter. Därför nya metoder behöver utvecklas som endast rikta den sjukdoms medla cellerna och lämna resterande immunförsvar intakt. Under det senaste decenniet en mängd cellbaserad immunoterapi strategier för att modulera T-cellmedierade immunsvar har utvecklats. De flesta av dessa metoder är beroende av toleransframkallande antigenpresenterande celler (APC). Men förutom att vara tekniskt svårt och besvärligt, sådana cellbaserade metoder är mycket känsliga för cytotoxiska T-cellssvar, vilket begränsar deras terapeutiska kapacitet. Här presenterar vi ett protokoll för generering av icke-cellulär mördar artificiella antigenpresenterande celler (KaAPC), vilket medger uttömning av patologiska T-celler medan de lämnar reåterstående immunförsvar orörd och funktionella. KaAPC är en alternativ lösning till cellulär immunterapi, som har potential för behandling av autoimmuna sjukdomar och allograft-avstötningar genom kontroll av oönskade T-cellsvar på ett antigen-specifikt sätt.
Under de senaste två decennierna har stora framsteg gjorts när det gäller att förstå de patogena mekanismerna hos autoimmuna sjukdomar. Men de vanligaste behandlingarna fortfarande är beroende kortikosteroider samt immunosuppressiva läkemedel såsom purinanaloger, alkylerande medel och kalcineurinhämmare 1. Användningen av sådana läkemedel har förbättrat prognosen för patienter, men behandlingen inte ger ett botemedel på den underliggande immunologiska fel. Dessutom patienter blir utsatta för infektioner och utveckling av cancer.
Därav det yttersta målet för behandling av T-cellsmedierade autoimmuna sjukdomar och allograftavstötning är att särskilt inrikta enda sjukdom som orsakar T-celler medan, samtidigt, lämnar återstående immunförsvar orörd och kompetent att slåss immunologiska sjukdomar. Utnyttja antigenpresenterande celler (APC) såsom en behandling för att undertrycka perifera T-cellsvar revs först så tidigt som1970-talet med flera grupper. Sedan dess har många cellbaserade metoder har utvecklats (över i Schütz et al. 2). Strategier som använder FasL uttrycker killer-APC som immunreglerande celler visade lovande resultat som indikerar terapeutisk potential för behandling av autoimmunitet, allograftavstötning och kroniska infektioner. Det finns dock betydande begränsningar med strategier som utnyttjar FasL Killer-APC som i slutändan har begränsat deras kliniska tillämpning; (I) produktion eller isolering av APC är tid, arbete och kostnadskrävande (ii) patienter som lider av cytopeni grund av immunosuppression ger begränsade belopp och kvalitet celler (iii) beläggning eller transduktion av APC med apoptos inducerande signaler såsom FasL ger mycket variabla fenotyper och (iv) Killer-APC är känsliga för cytotoxisk effektorfunktioner av T-celler därmed minska deras terapeutiska potential. Därför är det svårt att garantera en definierad reproducerbar Killer-APC fenotyp, som kan utnyttjas för antigen-specifik modulering av T-cellsvar in vivo.
Baserat på vår tidigare arbete med FasL uttrycker Killer-APC 3-5 och artificiella antigenpresenterande celler (AAPC) 6,7 utvecklade vi en pärla baserad metod (KaAPC) för antigenspecifik hämning eller eliminering av autoreaktiva T-celler i vitro. KaAPC bestå av en HLA-A2-Ig-dimer (signal 1) och en anti-Fas mAb (apoptosinducerande signal) kovalent immobiliserad på en yta av ett 4,5 | im paramagnetisk latexpärla. De utarma antigenspecifika T-celler i ett Fas / FasL-medierad mode från T-cellkulturer av multipla specificiteter i ett antigenspecifikt sätt och oberoende av aktiveringen inducerad celldöd (AICD) reaktionsvägen. Dosberoende apoptos i riktade T-celler induceras snabbt redan efter 30 min 8.
KaAPC lätt kan alstras på ett kontrollerat sätt säkerställer en definierad från hyllan phenotYP och övervinna de flesta av bristerna i cellbaserade utarmningsstrategier. Följaktligen KaAPC visar stor potential för behandling av T-cellsmedierade autoimmuna sjukdomar och allograftavstötning, avancera inom T-cellspecifika behandlingsstrategier.
Det mest kritiska steget i protokollet är att säkerställa en lämplig förhållandet mellan signal 1 (peptid MHC) och signal 2 (anti-Fas mAb). Vi har utfört intensiva titreringsexperiment att definiera den perfekta förhållande för signal 1 och 2; det blev uppenbart att minimala variationer på grund av skillnader i HLA-A2 Ig dimer eller anti-Fas mAb koncentrationer kan störa funktionaliteten i KaAPC. Sålunda bör alltid verifieras koncentrationen av båda signalerna och kvaliteten på både proteiner bör regelbundet testas, även om det beställdes från en kommersiell källa. Dessutom bör koncentrationerna alltid att bestämmas av samma analys som olika detektionsanalyser kan resultera i olika koncentrationer. Funktionalitet för HLA-A2-Ig kan också vara nedsatt på grund av ofullständig veckning och / eller ineffektiv peptid lastning. Dessutom dimer molekyler kan aggregera till olika grader, vilket skulle kunna påverka den funktionella aktiviteten hos proteinet. Därför actual mängden dimer som behövs för generering av en funktionell och specifik KaAPC kan variera. Dessutom fann vi att det önskade området för döden inducera signalen anti-Fas mAb på KaAPC är mycket snävt. I våra händer mängder större 3,64 mikrogram / ml leda till ospecifik dödandet av Fas positiva T-celler medan mängder under 3.64 g / ml resulterade i en dos-beroende minskat dödande aktivitet. Även om dessa förhållanden verkar ganska tight, kommer uppmärksamma dessa uppgifter leda till uppkomsten av en funktionell och specifik KaAPC.
Medan den nuvarande KaAPC fenotypen är funktionell för utarmning av aktiverade antigenspecifika T-celler, initiala experiment riktar naiva eller vilande antigenspecifika T-celler visade ingen signifikant induktion av antigenspecifik apoptos som dessa populationer har minskat Fas uttryck. Därför kan en envision tillsats av en samstimulerande signal på KaAPC att inducera uppreglering av Fas på vilande T-celler att aktivera demin ett mål för KaAPC. Även om detta är genomförbart alla tre signaler måste titreras noggrant för att säkerställa en funktionell KaAPC fenotyp.
Justering vulsten plattform till ett biokompatibelt eller biologiskt nedbrytbar matris kommer att förbättra KaAPC in vivo tillämpbarhet. Nyligen, Shen et al. Har rapporterat en framgångsrik in vivo-användning av KaAPC utnyttja 5 um latexpärlor konjugerade till anti-Fas (klon Jo2) och anti-His / H2-K b -TRP2 11. Vi har kunnat visa att det allmänna begreppet artificiella antigenpresenterande celler (AAPC) kan framgångsrikt överföras från um dimensionerad för att nm stora partiklar 12 och att funktionaliteten påverkas av partikelgeometri 13. Således, genom att variera storlek och / eller form av framtida KaAPC designs man skulle kunna påverka den in vivo funktionalitet och bio-distribution, som kan vara nyckeln till framgångsrik behandling av organspecifika autoimmuna sjukdomar.
<p class = "jove_content"> KaAPC vinna de stora bristerna i cellbaserade utarmning strategier som ett lättanvänt "från hyllan", tid och kostnadseffektiv metod som är oberoende av givar tillstånd och förbehandling. KaAPC inte mål för själv eller parakrint dödande signalering och inte känslig för cytolytiska effektorfunktioner av CTL. KaAPC kräver identifiering av den relevanta sjukdomen antigen och lita på deras specifika HLA-typ. Även idag många lämpliga HLA-A2 begränsade antigener för typ 1-diabetes, har GvHD och multiplar skleros identifierats 2, utveckling av ytterligare HLA klass I dimer molekyler samt den pågående identifiera nya autoimmuna relevanta antigener kommer att öka och bredda tillämpningen av KaAPC. Dessutom skulle man kunna tänka på att använda KaAPC riktas mot olika epitoper att rikta flera antigener samtidigt.Sammanfattningsvis KaAPC representera en flexibel plattform teknik för entigen-specifika T-cellstömning. Deras "lego-liknande" naturen gör att nya signaler såsom ytterligare samarbete stimulerande eller hämmande signaler såsom PD1 eller objekt på olika matriser, som skulle kunna bredda och förbättra deras senare in vitro och in vivo tillämpbarhet. Vi presenterar häri den steg-för-steg-protokoll för att generera KaAPC, den första vulsten baserad strategi för elimineringen av antigenspecifika T-celler från T-cell-blandningar med olika specificiteter.
Figur 3. KaAPC eliminera CTL på ett antigenspecifikt sätt PKH26-märkta aktiverade Fas + effektor-minnes-CTL och PKH67-märkta CMVpp65-specifik CTL från samma donator blandades till en 1:. Ett förhållande och samodlades med CMVpp65 KaAPC för 48 timmar. Kontrollkulturer behandlades med obelastad KaAPC, eller 1 pg / mllösligt anti-Fas-mAb (klon CH11). Minimal förlust av livsdugliga celler bestämdes i obehandlade blandade CTL-kulturer (T-blandning). Original FACS data för varje CTL population av T mix visas. Analys av apoptos utfördes som tidigare publicerats av separata gating både T-cellpopulationer 10. Siffror som avbildas i den övre vänstra kvadranterna representerar% av totala celler. Den illustrerar Siffran kommer från ett representativt experiment av tre oberoende försök. Denna forskning publicerades ursprungligen i blod. . Schütz, C. et al Killer artificiella antigenpresenterande celler: en ny strategi för att ta bort specifika T-celler Blood.. 2008, 111, 3546-52. Upphovsrätt American Society of Hematology. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har stöd av den tyska Research Foundation (DFG) SCHU-2681 / 1-1 (CS) och KFO 146 (MF), DOD försvarsdepartementet bidrags PC 040.972 (MO) och National Institute of Health ger RO1 CA108835 , RO1 Ai44129 (JPS)
Name | Company | Cat # | Comments |
PBS | Corning | 21-040-CV | |
human AB serum | Atlanta biologicals | S40110 | |
EDTA | Sigma/Aldrich | E5134 | |
sodium azide | Sigma/Aldrich | 71289 | |
M-450 epoxybeads | Invitrogen/Dynal | 14011 | |
MPC-1 magnet | Invitrogen/Dynal | 12001D | |
screw top glass vial | Fisher Scientific | 03-338AA | |
MACSmix Tube Rotator | Miltenyi | 130-090-753 | |
anti-CD95 (clone CH11) | Milliore | 05-201 | |
HLA-A2-Ig dimer | BD/Pharmingen | 551263 | |
Cryo-tube 2ml | Corning | 430488 | |
anti-mouse IgG1 PE | BD/Pharmingen | 559320 | |
anti-mouse IgM FITC | BD/Pharmingen | 553408 | |
sodium chloride | Merck | S271-3 | |
calcium chloride | Sigma/Aldrich | C5080 | |
HEPES | cellgro/Mediatech | 25-060-CI | |
RPMI | gibco/life technologies | 11875-085 | |
96well round bottom plate | Falcon | 353077 | |
AnnexinV FITC | PromoKine | PK-CA577-1001-1000 | |
7-AAD | BD/Pharmingen | 51-68981E | |
FACS tubes | Falcon | 352008 |