باستخدام تراكب الفحص لقياس نوعيا الإنتاج الجرثومي من والحساسية للالرئوية Bacteriocins
Summary
Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species. Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.
Abstract
Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.
Introduction
العقدية الرئوية، وهي المستعمر المشترك للمجتمع متعدد المكروبات من البلعوم الأنفي، غير قادرة على المنافسة مع الآخرين، والمكورات الرئوية وثيقي الصلة من خلال إنتاج الببتيدات المضادة للميكروبات أنتجت البكتريا (bacteriocins). كل سلالة المكورات الرئوية التسلسل بالكامل بحثت حتى الآن يحتوي على نسخة من ب acteriocin- ل آيك ص eptide موضع، BLP. وقد تجلى إنتاج مبيد جرثومي من المكورات الرئوية إلى أن تكون مهمة في نتائج سواء في المختبر وفي الجسم الحي المنافسة 1-4. وتتأثر ديناميكية تنافسية من خلال التعبير عن bacteriocins المتنوعة جنبا إلى جنب مع البروتينات الحصانة وما شابه ذلك ردا على الببتيد فرمون محددة. يتم التحكم تحريض موضع BLP عن طريق نظام الاستشعار عن النصاب فيه فرمون الببتيد، BlpC، بربط كيناز الاستشعار، BlpH، ويبدأ شلال يشير مما أدى إلىالنسخ من موضع 5،6 BLP. هناك أربعة اختلافات أليلية من BlpC أن كل مأزق لBlpH المشابهة لها 6. للخلية من أجل البقاء آثار مبيد جرثومي الخاص بها، ونسخه الجينات التي تشفر البروتينات الحصانة وما شابه ذلك على نفس الاوبرون حيث أن كل من الجينات مبيد جرثومي. يحدث إذا قتل سلالة منافس غير قادر على upregulate موضع BLP ردا على فرمون خارجي أو، إذا كان يفتقر إلى سلالة الجين الحصانة معين المطلوبة للحماية. مجمع نقل، مطلوب BlpAB عن إفراز وتجهيز فرمون الببتيد والببتيدات مبيد جرثومي 2،4. في الآونة الأخيرة، فقد تبين أن نسبة كبيرة من سلالات المكورات الرئوية هي "الغشاشون" يعني لديهم طفرة في الجين الحفظ blpA مما يجعلها غير قادرة على إفراز الفيرمونات وbacteriocins 1،2. هذه السلالات هي قادرة على الاستجابة لBlpC خارجية المنشأ 2 يفرزها صهيلسلالات مملة السماح لإنتاج البروتينات الحصانة.
وعلى الرغم من الاستعدادات الخام من bacteriocins من supernatants يمكن إعداد من سلالات منتج باستخدام أساليب الخطوات البيوكيميائية لتحقيق النقاء، وهذا النهج ليس مفيدا لفحص مجموعات كبيرة من العزلات وإذا كان مستوى التعبير مبيد جرثومي منخفضة في مرق نمت الثقافات 2،7- 9. يستخدم الفحص تراكب كوسيلة سريعة للتحقيق في الديناميات التنافسية بين السلالات التي قد تكون موجودة في المختبر. للقيام بذلك، سلالة المكورات الرئوية هو على لوحة آغار وسمح لتنمو لتحقيق تركيزات البكتيرية محلية كافية لتحريض موضع BLP تلقيح مسبقا. ثم يتم تلقيح سلالة الثاني في حل أجار لينة المنصهر التي يتم بعد ذلك تطبيقها على سلالة تلقيح قبل لاختبار حساسية. لتقييم لنشاط موضع BLP (مستقلة عن النشاط المثبطة)، سلالات يمكن مضافين مع سلسلة من عشرالعناصر الأرضية النادرة التي سبق وصفها سلالات مراسل BlpC. شيدت هذه السلالات لاحتواء واحد من ثلاثة blpH الأليلات المختلفة التي تستجيب لالفيرومونات BlpC الثلاثة الأكثر شيوعا التي يفرزها المكورات الرئوية. سلالات مراسل لها الجين lacZ المتكاملة التي هي تحت سيطرة المروج يعتمد BlpH وتحمل الحذف في الجينات blpC يمنع التحفيز الذاتي 10،11.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا الاختبار تراكب هو وسيلة سريعة لتحديد نطاق النشاط للمنتجين مبيد جرثومي وإظهار التفاعلات التنافسية التي قد تحدث بين سلالات المكورات الرئوية. الفحص تراكب يمكن تكييفها لاستخدامها لفحص سلالات متعددة لإنتاج مبيد جرثومي على لوحة واحدة. قمنا بنجاح فحص مجموعات سلالة كب…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been supported by Elizabeth E. Kennedy Research Award.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Fisher | B21261X | For growth from freezer cultures |
| Catalase | Sigma | C100-500mg | 4,741 Units per plate |
| Todd Hewitt Broth + Yeast Extract (THY) | Fisher | DF0492-17-6 | 30 g of THB, 5 g yeast extract, 1 L ddH20 autoclave |
| Trypticase Soy Broth + Agar plates (TSA) | Fisher | B11768 | 30 g of TS, 15 g agar, 1 L ddH20 autoclave |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma | B4252-50MG | Dissolve in dimethylformamide |
| Petri dishes | Fisher | FB0875712 | |
| Spectrophometer | Measures the OD620 of cultures | ||
| 37 °C water bath | |||
| 37 °C incubator with 5% CO2 | |||
| 15 ml conical tube |
References
- Dawid, S., Roche, A. M., Weiser, J. N. The blp bacteriocins of Streptococcus pneumoniae mediate intraspecies competition both in vitro and in vivo. Infect Immun. 75 (1), 443-451 (2007).
- Sawa, N., et al. Isolation and characterization of enterocin W, a novel two-peptide lantibiotic produced by Enterococcus faecalis NKR-4-1. Appl Environ Microbiol. 78 (3), 900-903 (2012).
- Kochan, T. J., Dawid, S. The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion. J Bacteriol. 195 (7), 1561-1572 (2013).
- Lux, T., Nuhn, M., Hakenbeck, R., Reichmann, P. Diversity of bacteriocins and activity spectrum in Streptococcus pneumoniae. J Bacteriol. 189 (21), 7741-7751 (2007).
- Reichmann, P., Hakenbeck, R. Allelic variation in a peptide-inducible two-component system of Streptococcus pneumoniae. FEMS Microbiol Lett. 190 (2), 231-236 (2000).
- Saizieu, A., et al. Microarray-based identification of a novel Streptococcus pneumoniae regulon controlled by an autoinduced peptide. J Bacteriol. 182 (17), 4696-4703 (2000).
- Barbour, A., Philip, K., Muniandy, S. Enhanced production, purification, characterization and mechanism of action of salivaricin 9 lantibiotic produced by Streptococcus salivarius NU10. PLoS One. 8 (10), 77751 (2013).
- Wladyka, B., et al. Isolation, biochemical characterization, and cloning of a bacteriocin from the poultry-associated Staphylococcus aureus strain CH-91. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (16), 7229-7239 (2013).
- Shea, E. F., et al. Bactofencin a, a new type of cationic bacteriocin with unusual immunity. 4 (6), 00498-00413 (2013).
- Son, M. R., et al. Conserved mutations in the pneumococcal bacteriocin transporter gene, blpA, result in a complex population consisting of producers and cheaters. MBio. 2 (5), (2011).
- Kochan, T. J., Dawid, S. The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion. J Bacteriol. 195, 1561-1572 (2013).
- Widdick, D. A., et al. Cloning and engineering of the cinnamycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 4316-4321 (2003).
- Begley, M., Cotter, P. D., Hill, C., Ross, R. P. Identification of a novel two-peptide lantibiotic, lichenicidin, following rational genome mining for LanM proteins. Appl Environ Microbiol. 75 (17), 5451-5460 (2009).
