Utilisation de l'Essai de superposition pour mesurer qualitativement la production bactérienne et la sensibilité à pneumocoque bactériocines
Summary
Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species. Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.
Abstract
Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.
Introduction
Streptococcus pneumoniae, un colonisateur commun de la communauté polymicrobien du nasopharynx, est en mesure de rivaliser avec d'autres pneumocoques et des espèces étroitement apparentées par la production de peptides antimicrobiens produits par des bactéries (des bactériocines). Chaque souche pneumococcique entièrement séquencé examiné à ce jour contient une version de la b acteriocin- l ike p eptide lieu, blp. Production de bactériocine par le pneumocoque a été démontré un rôle important dans les résultats de la fois in vitro et in vivo à concurrence de 1 à 4. Dynamique de compétition sont influencés par l'expression de diverses protéines ainsi que les bactériocines de l'immunité apparentées en réponse à une phéromone peptide spécifique. L'induction de la BLP locus est commandé par un système de détection de quorum dans lequel une phéromone peptidique, BLPC, se lie à la kinase de capteur, BlpH, et initie une cascade de signalisation aboutissant à latranscription du locus 5,6 blp. Il ya quatre variations alléliques de BLPC qui lient chacun à sa BlpH apparenté 6. Pour la cellule de survivre aux effets de son propre bactériocine, les gènes qui codent pour des protéines apparentées à l'immunité sont transcrits sur le même opéron que chacun des gènes des bactériocines. Tuer se produit si une souche de compétiteur n'est pas en mesure de réguler à la hausse le locus blp en réponse à la phéromone ou exogènes, si la souche est dépourvue du gène de l'immunité spécifique requis pour la protection. Le complexe de transporteur, BlpAB est requis pour la sécrétion et le traitement de la phéromone de peptides et les peptides de bactériocines 2,4. Récemment, il a été montré qu'une proportion importante des souches de pneumocoques sont les "tricheurs" qui signifie qu'ils ont une mutation dans le gène conservé APLE qui les rend incapables de sécréter des phéromones et des bactériocines 1,2. Ces souches sont capables de répondre à BLPC exogène 2 sécrétée par hennissementsouches de perçage permettant la production de protéines d'immunité.
Bien que, préparations brutes de bactériocines de surnageants peuvent être préparés à partir de souches de producteurs utilisant des méthodes biochimiques étapes pour atteindre la pureté, cette approche n'est pas utile pour le criblage de grandes collections d'isolats et si le niveau d'expression des bactériocines est faible dans le bouillon cultivé cultures 2,7- 9. Le test de recouvrement est utilisé comme un moyen rapide pour étudier la dynamique de concurrence entre les souches qui peuvent exister in vitro. Pour ce faire, une souche pneumococcique est pré-inoculées sur une plaque de gélose et on a laissé croître pour atteindre des concentrations bactériennes locales suffisantes pour l'induction de la BLP locus. Une seconde souche est ensuite inoculée dans une solution d'agar mou fondu qui est ensuite appliqué sur la souche pré-inoculé à tester pour la sensibilité. Pour évaluer l'activité du locus blp (indépendante de l'activité inhibitrice), les souches peuvent être superposées avec une série de three souches rapporteurs BLPC décrites précédemment. Ces souches ont été construites pour contenir l'un des trois allèles blpH différents qui répondent aux trois phéromones les plus courantes BLPC sécrétées par le pneumocoque. Les souches rapporteurs ont un gène lacZ intégré qui est sous le contrôle d'un promoteur dépendant de BlpH et portent une délétion dans le gène qui prévient BLPC auto-stimulation 10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce test de superposition est un moyen rapide de déterminer l'étendue des activités des producteurs de bactériocines et de démontrer les interactions compétitives qui peuvent survenir entre les souches de pneumocoques. Le dosage de recouvrement peut être adapté pour utiliser pour le criblage de souches multiples pour la production de bactériocine sur une seule plaque. Nous avons passé au crible avec succès de grandes collections de souches avec ce dosage en utilisant un duplicateur de 48 broches pour inocu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been supported by Elizabeth E. Kennedy Research Award.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Fisher | B21261X | For growth from freezer cultures |
| Catalase | Sigma | C100-500mg | 4,741 Units per plate |
| Todd Hewitt Broth + Yeast Extract (THY) | Fisher | DF0492-17-6 | 30 g of THB, 5 g yeast extract, 1 L ddH20 autoclave |
| Trypticase Soy Broth + Agar plates (TSA) | Fisher | B11768 | 30 g of TS, 15 g agar, 1 L ddH20 autoclave |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma | B4252-50MG | Dissolve in dimethylformamide |
| Petri dishes | Fisher | FB0875712 | |
| Spectrophometer | Measures the OD620 of cultures | ||
| 37 °C water bath | |||
| 37 °C incubator with 5% CO2 | |||
| 15 ml conical tube |
References
- Dawid, S., Roche, A. M., Weiser, J. N. The blp bacteriocins of Streptococcus pneumoniae mediate intraspecies competition both in vitro and in vivo. Infect Immun. 75 (1), 443-451 (2007).
- Sawa, N., et al. Isolation and characterization of enterocin W, a novel two-peptide lantibiotic produced by Enterococcus faecalis NKR-4-1. Appl Environ Microbiol. 78 (3), 900-903 (2012).
- Kochan, T. J., Dawid, S. The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion. J Bacteriol. 195 (7), 1561-1572 (2013).
- Lux, T., Nuhn, M., Hakenbeck, R., Reichmann, P. Diversity of bacteriocins and activity spectrum in Streptococcus pneumoniae. J Bacteriol. 189 (21), 7741-7751 (2007).
- Reichmann, P., Hakenbeck, R. Allelic variation in a peptide-inducible two-component system of Streptococcus pneumoniae. FEMS Microbiol Lett. 190 (2), 231-236 (2000).
- Saizieu, A., et al. Microarray-based identification of a novel Streptococcus pneumoniae regulon controlled by an autoinduced peptide. J Bacteriol. 182 (17), 4696-4703 (2000).
- Barbour, A., Philip, K., Muniandy, S. Enhanced production, purification, characterization and mechanism of action of salivaricin 9 lantibiotic produced by Streptococcus salivarius NU10. PLoS One. 8 (10), 77751 (2013).
- Wladyka, B., et al. Isolation, biochemical characterization, and cloning of a bacteriocin from the poultry-associated Staphylococcus aureus strain CH-91. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (16), 7229-7239 (2013).
- Shea, E. F., et al. Bactofencin a, a new type of cationic bacteriocin with unusual immunity. 4 (6), 00498-00413 (2013).
- Son, M. R., et al. Conserved mutations in the pneumococcal bacteriocin transporter gene, blpA, result in a complex population consisting of producers and cheaters. MBio. 2 (5), (2011).
- Kochan, T. J., Dawid, S. The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion. J Bacteriol. 195, 1561-1572 (2013).
- Widdick, D. A., et al. Cloning and engineering of the cinnamycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 4316-4321 (2003).
- Begley, M., Cotter, P. D., Hill, C., Ross, R. P. Identification of a novel two-peptide lantibiotic, lichenicidin, following rational genome mining for LanM proteins. Appl Environ Microbiol. 75 (17), 5451-5460 (2009).
