באמצעות assay הכיסוי למדוד את הייצור בקטריאלי ורגישות לדלקת הריאות Bacteriocins איכותי
Summary
Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species. Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.
Abstract
Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.
Introduction
Streptococcus pneumoniae, קולוניאלי משותפת של קהילת polymicrobial של לוע האף, הוא מסוגל להתחרות עם pneumococci אחר ומינים קרובים באמצעות הייצור של פפטידים מיקרוביאלית מיוצרים bacterially (bacteriocins). כל זן דלקת ריאות באופן מלא רצף שנבחן עד היום מכיל גרסה של מוקד acteriocin- ב אייק l eptide עמ ', BLP. ייצור Bacteriocin ידי pneumococcus הודגם להיות חשוב בתוצאות הן במבחנה בתחרות vivo 1-4. דינמיקה תחרותית מושפעת מהביטוי של bacteriocins המגוון יחד עם חלבוני חסינותו מקור בתגובה לפרומון פפטיד ספציפי. אינדוקציה של מוקד BLP נשלטת על ידי מערכת חישת מניין שבו פרומון פפטיד, BlpC, נקשר לקינאז החיישן, BlpH, ויוזם מפל איתות וכתוצאה מכךשעתוק של 5,6 מוקד BLP. ישנם ארבע וריאציות allelic של BlpC שכל נקשרים לBlpH המקור שלה 6. לתא כדי לשרוד את ההשפעות של bacteriocin משלו, הגנים המקודדים את חלבוני חסינותו מקור מתועתקים באותו אופרון ככל אחד מהגנים bacteriocin. הרג מתרחש אם זן מתחרה הוא לא מסוגל upregulate מוקד BLP בתגובה לפרומון אקסוגניים או, אם הזן חסר את גן החסינות הספציפי הנדרש להגנה. המורכב טרנספורטר, BlpAB נדרש להפרשה והעיבוד של פרומון פפטיד ופפטידים bacteriocin 2,4. לאחרונה, הוכח שחלק משמעותי מזני דלקת ריאות הם "רמאים", כלומר יש להם מוטציה שמורה בגן blpA אשר הופך אותם מסוגל להפריש פרומונים וbacteriocins 1,2. זנים אלה מסוגלים להגיב לBlpC אקסוגניים 2 מופרש על ידי צהלהזנים משעממים המאפשרים הייצור של חלבוני חסינות.
אמנם, הכנות גולמי של bacteriocins מsupernatants ניתן להכין מזני מפיק באמצעות צעדי שיטות ביוכימיות להשגת טוהר, גישה זו אינה שימושית לסינון אוסף גדולה של בידודים ואם רמת ביטוי bacteriocin היא נמוכה בתרבויות מרק גדל 2,7- 9. Assay הכיסוי משמש כדרך מהירה כדי לחקור את הדינמיקה התחרותית בין זנים שעלולים להתקיים במבחנה. לשם כך, מתח דלקת ריאות הוא על צלחת אגר ואפשרו לגדול כדי להשיג ריכוזי חיידקים מקומיים מספיקים לאינדוקציה של מוקד BLP-מחוסן מראש. זן שני הוא מחוסן אז לפתרון אגר רך מותך אשר לאחר מכן מיושם על זן מחוסן מראש לבדיקת רגישות. כדי להעריך את הפעילות של מוקד BLP (עצמאית של פעילות מעכבת), יכולים להיות מעולף זנים בסדרה של הרי זני כתב BlpC שתוארו קודם לכן. זנים אלו נבנו כדי להכיל אחד משלושה אללים blpH שונים שמגיבים לשלושה פרומונים BlpC הנפוצים ביותר מופרשים על ידי pneumococci. יש לי זני כתב גן lacZ משולב שנמצא תחת השליטה של אמרגן תלוי BlpH ולבצע מחיקה בגן blpC המונע גירוי עצמי 10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
assay הכיסוי זוהי דרך מהירה כדי לקבוע את הטווח של פעילות עבור יצרני bacteriocin ולהפגין אינטראקציות תחרותיות שעלולות להתרחש בין זני דלקת ריאות. Assay הכיסוי יכול להיות מותאם לשימוש עבור הקרנת זנים מרובים לייצור bacteriocin על צלחת אחת. יש לנו הוקרנו בהצלחה אוספי מתח גדולים עם assay זה …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been supported by Elizabeth E. Kennedy Research Award.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Fisher | B21261X | For growth from freezer cultures |
| Catalase | Sigma | C100-500mg | 4,741 Units per plate |
| Todd Hewitt Broth + Yeast Extract (THY) | Fisher | DF0492-17-6 | 30 g of THB, 5 g yeast extract, 1 L ddH20 autoclave |
| Trypticase Soy Broth + Agar plates (TSA) | Fisher | B11768 | 30 g of TS, 15 g agar, 1 L ddH20 autoclave |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma | B4252-50MG | Dissolve in dimethylformamide |
| Petri dishes | Fisher | FB0875712 | |
| Spectrophometer | Measures the OD620 of cultures | ||
| 37 °C water bath | |||
| 37 °C incubator with 5% CO2 | |||
| 15 ml conical tube |
References
- Dawid, S., Roche, A. M., Weiser, J. N. The blp bacteriocins of Streptococcus pneumoniae mediate intraspecies competition both in vitro and in vivo. Infect Immun. 75 (1), 443-451 (2007).
- Sawa, N., et al. Isolation and characterization of enterocin W, a novel two-peptide lantibiotic produced by Enterococcus faecalis NKR-4-1. Appl Environ Microbiol. 78 (3), 900-903 (2012).
- Kochan, T. J., Dawid, S. The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion. J Bacteriol. 195 (7), 1561-1572 (2013).
- Lux, T., Nuhn, M., Hakenbeck, R., Reichmann, P. Diversity of bacteriocins and activity spectrum in Streptococcus pneumoniae. J Bacteriol. 189 (21), 7741-7751 (2007).
- Reichmann, P., Hakenbeck, R. Allelic variation in a peptide-inducible two-component system of Streptococcus pneumoniae. FEMS Microbiol Lett. 190 (2), 231-236 (2000).
- Saizieu, A., et al. Microarray-based identification of a novel Streptococcus pneumoniae regulon controlled by an autoinduced peptide. J Bacteriol. 182 (17), 4696-4703 (2000).
- Barbour, A., Philip, K., Muniandy, S. Enhanced production, purification, characterization and mechanism of action of salivaricin 9 lantibiotic produced by Streptococcus salivarius NU10. PLoS One. 8 (10), 77751 (2013).
- Wladyka, B., et al. Isolation, biochemical characterization, and cloning of a bacteriocin from the poultry-associated Staphylococcus aureus strain CH-91. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (16), 7229-7239 (2013).
- Shea, E. F., et al. Bactofencin a, a new type of cationic bacteriocin with unusual immunity. 4 (6), 00498-00413 (2013).
- Son, M. R., et al. Conserved mutations in the pneumococcal bacteriocin transporter gene, blpA, result in a complex population consisting of producers and cheaters. MBio. 2 (5), (2011).
- Kochan, T. J., Dawid, S. The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion. J Bacteriol. 195, 1561-1572 (2013).
- Widdick, D. A., et al. Cloning and engineering of the cinnamycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 4316-4321 (2003).
- Begley, M., Cotter, P. D., Hill, C., Ross, R. P. Identification of a novel two-peptide lantibiotic, lichenicidin, following rational genome mining for LanM proteins. Appl Environ Microbiol. 75 (17), 5451-5460 (2009).
