제시 한 쥐의 등쪽 피하 지방 챔버의 창은 musculocutaneous 플랩의 급성 지속적인 허혈 영역을 시각화. 미세 혈관 및 혈류 역학의 정량의 직접적이고 반복적 인 평가를위한 생체 내에 에피 형광 현미경 수 있습니다. 형태 학적 및 혈역학 적 결과는 더 조직 학적 및 분자 분석과 관련 될 수있다.
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방법 논문
마우스의 등쪽 피하 지방 상공 회의소에서 허혈성 조직 손상 : 피부 플랩 모델은 급성 영구 허혈을 조사하기
이 논문에서
요약
초록
깊은 전문 지식과 첨단 수술 기법에도 불구하고, 광범위한 조직 괴사에 상처 고장에 이르기까지 허혈에 의한 합병증은 여전히 특히 재건 플랩 수술에서 발생한다. 여러 실험 플랩 모델은 근본 원인과 메커니즘을 분석하고 허혈성 합병증을 예방하는 치료 전략을 조사하기 위해 개발되었다. 대부분의 모델의 제한 요소는 직접 반복적으로 미세 혈관 구조와 혈류 역학을 시각화하는 부족 가능성이다. 프로토콜의 목적은 앞서 언급이 부족한 요소 affiliating 잘 확립 된 마우스 모델을 제시하는 것이었다. 세게 등은. 치료 유지가 10 일 후에 50 %의 괴사 ~ 급성 지속적 허혈 및 결과를 거쳐 임의의 관류 패턴 musculocutaneous 플랩의 모델을 개발했다. 생체 내에 에피 형광 현미경의 도움으로,이 모델은 챔버의 반복적 시각화를 허용형태와 시간에 관심의 다른 지역에서 혈역학. 이러한 세포 사멸, 염증, 미세 혈관 누출 및 혈관 신생과 같은 관련 프로세스 조사 및 단백질 분자 및 면역 분석법에 상관 될 수있다. 지금까지 모델은 ischemically 도전 조직의 전, 수술 주변의 효과와 postconditioning을 조사 여러 출판 실험 연구에서 타당성과 재현성을 입증했다.
서론
재건 수술에 노출 힘줄, 뼈와 임플란트 재료의 범위가 플랩의 사용에 의존한다. 플랩은 동맥 유입과 정맥 유출을 보장 혈관 척추 경에 전송되는 조직의 블록입니다. 폭 넓은 전문 지식과 전송 될 플랩의 다양한 가능성에도 불구하고, 전체 조직의 손실에 상처 고장에 이르기까지 허혈에 의한 합병증은 여전히 발생하고 있습니다. 보조 의사에 의한 보존 적 치료와 치유가 작은 조직 괴사 후 예상 할 수있는 반면, 상당한 플랩 괴사는 일반적으로 변연 절제술, 상처 조절 및 보조 재건을 포함하여 수술 개정을 필요로합니다. 이것은, 이환율을 증가 입원 기간을 연장하고 결과적으로 증가 건강 관리 비용을 초래.
동맥 유입에서 가장 먼 먼 영역에서 혈관의 정의되지 않은 패턴 또는 무작위로 살포 지역과 플랩은 허혈성 손상에 특히 경향이있다. ACCO rdingly 수많은 실험 및 임상 연구 모두에서 괴사 현상을 평가 한 축 패턴 플랩 (정의 혈액 공급) 및 임의의 패턴 플랩 (정의되지 않은 혈액 공급) 1-3. 주요 연구 결과는 일반적으로 괴사 영역의 크기의 거시적 평가를 기준으로합니다. 원인과 조직 괴사 기전을 평가하기 위해 더 자세하게, 몇몇 연구는 미세 순환의 분석에 초점을 맞추었다. 다른 기술은 폴라 전극들 4-5을 사용하여 조직 산소 장력의 분석뿐만 아니라, 레이저 도플러 flowmetry 6-7, 염료 확산 8 및 미소 9-10를 이용하여 혈류량의 측정을 포함하여, 조직 관류를 측정하는 데 사용되어왔다. 이러한 기술은, 단, 조직 관류의 간접 파라미터를 측정하기위한 허용 플랩의 관심 영역 내에 개별 microhemodynamic 임의의 공정 형태소 해석을 가능하게하지 않는다.
t "> Sandison 그는 토끼 (11)에서 수행 생체 내 연구에 연장을위한 투명 챔버를 사용하는 한 사람을 첫 번째로 알려져있다 1943 년 -. 약 20 년 후 - Algire는 적용 할 수 이러한 투명 챔버를 적용하는 첫번째이었다 종양 세포 (12)의 마이크로 임플란트의 행동을 연구하기 위해 쥐. 때문에 마우스가 느슨한 피부 동물을 소위 다음과 같은 년 동안 몇 가지 기술적 인 개선 후, 레어와 동료 등을 적용 할 수 있었다는 사실에 작고 가벼운 티탄 챔버 개발 등쪽 피하 지방 챔버.이 챔버는 생체 내에 형광 현미경, 형태 학적 및 미세 순환 기능의 수와 다른 생리 학적 및 병태 생리 학적 조건에서 시간에 따른 이들의 변화를 직접 반복적 시각화를 허용하는 기술 등을 이용하여 평가를 활성화 허혈 - 재관류 손상 13.PE의 조사에정상 및 병적 인 상태에서 피부, 근육과 뼈 플랩의 rfusion 두 가지 추세가 발생했습니다 : 첫째, 마우스 (14)의 유경 귀 플랩으로 등쪽 피하 지방 챔버를 사용하지 않는 "급성"플랩 모델, 측면을 기반으로 섬 피부 플랩 햄스터 (15)와 쥐 (16)의 유경 복합 플랩. 둘째, 등쪽 피하 지방 챔버 허가 반복적 인 미세과 플랩의 조합이 생체 내에 형광 현미경으로 몇 일 동안 분석 "만성"플랩 모델. 그것은 마우스 (17)의 피하 지방 챔버에 통합되어 무작위로 관류 musculocutaneous 플랩으로 구성되어 있습니다. 그 폭과 길이의 비율은 영구 급성 허혈 상황 일관 10-14일 플랩 입면 후 50 % 플랩 조직 괴사 ~ 결과 것으로 선택되었다. 조직 괴사의이 재현 범위는, 보호 (즉, 개발 레 모두의 추가적인 평가를 할 수 있습니다의 괴사) 및 유해 요인 (즉, 플랩 병태 생리에 대한 자세한 괴사의 개발). 지난 년 동안, 다른 주 산기 사전, 및 조직 보호 물질 18-24의 관리 및 열 (25)과 충격파 (26)과 같은 생리 학적 스트레스의 로컬 응용 프로그램을 포함하여 사후 조절 절차의 효과를 입증하는 여러 가지 실험 출판물, 등장했다.
괴사, 미세 혈관 모폴로지 및 미세 파라미터의 정량적 분석은 또한 면역 분석 및 단백질 분석과 상관 될 수있다. 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 산화 질소 합성 효소 (NOS), 핵 인자 카파 B (NF-κB) 및 열 충격 단백질 (HSP-32을 포함하는 다양한 단백질 및 분자 : 헴 시게나 1 (HO-1) 및 HSP- 70) 조직의 보호에 중요한 역할을하는 것으로 나타났다. 이 챔버 플랩 모델에 기초하여, 두 개의 변형 순으로 하였다 개발되어왔다R은 축 패턴 관류 (28)와 유경 플랩 피부 이식 치료 (27)과 혈관 개발하는 동안 신생 혈관 및 미세 순환을 분석합니다. 우리는 마우스 피하 지방 챔버 ischemically 도전 musculocutaneous 플랩 포함 재현성 및 신뢰성있는 모델을 제시한다. 이 모델은 생체 내에 에피 형광 현미경에 의한 미세 순환 및 혈류 역학의 시각화 및 정량화 할 수 있습니다.
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프로토콜
참고 : 이전에 제시된 모델의 구현에, 해당 동물 보호법이 협의되어야하며, 권한 지방 자치 단체에서 얻을 수 있어야합니다. 본 연구에서는 모든 실험은 연구와 관련된 동물에 대한 원칙과 동물의 보호에 관한 독일 법률을 준수 하였다. 실험은 지역 동물 보호위원회에 의해 승인되었다.
1. 동물 준비 및 플랩의 외과 상승
- 22 ~ 24 ° C에서의 실내 온도에서 12 시간 밤낮주기 60~65%의 상대 습도에서 하나의 케이지에 동물이 오지 않게하십시오. 식수 및 표준 실험실 차우에 마우스 무료로 액세스 할 수 있습니다. 항상 생존 수술시 무균 조건을 유지한다.
- 90 ㎎ / kg BW 케타민 염산염을 25㎎ / 함유하는 10g의 BW 당 0.1 ml의 식염수를 복강하여 마우스를 마취 (IP) 주입kg bw의 dihydroxylidinothiazine 염산염. 마취는 동물 준비, 수술 이후 현미경 필요합니다. 고통스러운 자극에 대한 반응을 확인하여 적절한 마취를 확인합니다. 마취의 시간 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 적용합니다.
- 충분한 마취 유도 후, 전기 면도기 뒷면에 털을 뽑다. 이하, 나머지 머리를 제거하는 면도 영역 제모 크림을 적용합니다.
- 7-10 분 ~의 제모 크림의 체류 시간 동안 피부의 집게와 마이크로 집게, 가위 및 마이크로 가위, 봉합사 및 마커 펜을 포함하여 악기를 준비합니다. 소독 챔버의 바닥에있는 너트와 나사 두 개를 적용하여 챔버 시스템의 기밀성을 보장하기 위해 챔버의 대응의 창 주위에 자체 접착 거품 (그림. 1 AC)를 고정하여 티타늄 챔버를 준비합니다.
- 세척하여 다시 모든 탈모 크림을 제거미지근한 물로 닦아주십시오. 이어서 건조 및 알코올 - 함유 용액과 피부를 소독.
- 발생하기 쉬운 위치에 마우스를 놓고 뒷면의 중간 선을 정의합니다. 중앙 피부를 잡고 배 (그림. 2A)을 작성하여 올립니다. 광원의 종류를 사용하여 트랜스 조명으로 provisorily 티타늄 프레임 (그림. 2B)를 배치 할 위치를 결정합니다. 있는지 확인 두개쪽으로 측면 흉부 동맥 (LTA)와 챔버의 윈도우의 중심을 미부 물론 깊은 곡절 장골 동맥 (DCIA)의 말단 지점 (그림. 2B-D). 챔버의 위치 결정이 완료되면, 티탄 프레임 이후 고정 용 배의 매우 하단 피부 양 층을 관통. 이제, 티탄 프레임을 제거하기 쉬운 위치에 마우스를 위치시키고 필요하다면 백의 정중선을 재정의.
- 척추 (15), X (1)의 폭과 길이의 비율이 정중선에서 시작에 수직 플랩 개요1mm는 측면을 기반으로 무작위로 관류 플랩이 발생할 수 있습니다. 그런 다음 반대쪽까지 연장 2mm의 추가 피부 영역 개요 (그림. 2C, D). 이 영역 포셉 고른 이상 가시 플랩 영역을 방해하지 않고 티타늄 프레임에 봉합된다.
- 마킹 최종 후, 플랩을 절개. 이 과정에서 LTA 및 DCIA 모두를 가로로 쪼개다 플랩 (그림. 2E)을 상승. 가로로 혈관의 응고 또는 결찰은 필요 없다.
- 이전에 만든 피부 구멍 (그림. 2 층)를 통해 챔버의 나사를 배치하고 챔버의 프레임의 구멍과 5-0를 사용하여 프레임의 뒷면 부분에 높은 플랩의 챔버의 프레임 안에 모두 전방과 후방으로 피하 지방을 흥분시키는 단속 봉합 (그림. 2G).
- (5-0 중단 봉합에 의해서 피부에 다시 주변 플랩의 수직 사지 봉합 그림. 2H, I).
- 플랩의 혈관을 관찰하기 위해 플랩의 반대편에, 즉 2mm의 작은 피부 스트립 피부 측방 헤미 원형 영역을 절제. 이 90mm (2)의 표면을 갖는 챔버의 관찰 창을 통해 직접 볼 수있다.
- 현미경 동안 이미지 품질을 향상시키기 위해 미세 수술기구 및 광 확대 렌즈 또는 현미경을 사용하는 횡문근에서 젤라틴 같은 느슨한 유륜 조직을 제거한다. 근육 조직 계층 내에서 혈관이 손상되지 않도록하십시오.
- 마지막으로, 국소 bisbenzimide 식염수 (도. 2J)와 플랩 이슬로 축축하게하다, 두개쪽으로 및 후방 이전에 전방으로 발포체의 자기 접착 스트립 옷 입기 된 프레임의 대응을 장착함으로써 챔버를 밀봉. 그 후, 스냅 링을 이용하여 커버 유리와 관찰 창을 적용한다. 유리 아래로 어떤 공기 물집을 모함하지 않으려 고한다 (도. 2K, L). 피부 접착력에 의해 커버 유리에 부착된다.
2. 생체 내에 표면 형광 현미경
- 이상적인 광학 품질에 대한 최초의 현미경 분석을위한 수술 준비 후 24 시간을 기다립니다. 이 분석은 현미경의 기준을 나타내고, 수술 후 3 일째, 5, 7 및 10에서 반복된다. 단계 1.2에 기재된 바와 같이마다 마우스를 마취. 주문 제작 플렉시 글라스 캐리어 측면 decubital 위치에 동물을 놓습니다. 그런 식으로, 커버 유리에 부착 된 플랩의 근육 조직 층이 최대 병동에 직면하고있다.
- 꼬리 정맥 또는 레트로 안구 정맥총에 5 %의 녹색 형광 덱스 트란 (분자량 15 만) 0.05 ml의 1 % 높은 형광 로다 민 가족 염료의 0.05 ㎖를 주입한다. 녹색 형광 덱스 트란 정맥 내 적용시 혈액 비 세포 성분 얼룩 (ⅳ). DIST 할 수있는 형광 로다 민 얼룩 백혈구 및 혈소판다른 셀룰러 및 비 셀룰러 성분으로부터 inguished. 마지막으로, 응축의 상태에 따라 더 많거나 적은 형광 발광 핵 성분 bisbenzimide 얼룩.
- 그 후, 현미경으로 마우스를 놓습니다. 현미경은 LED 시스템을 포함 확인 - 470 및 425 nm의, 365 및 490 nm의, 540 및 580 nm의에 대한 LED 빔 조합뿐만 아니라 해당 필터 세트 (62 HE BFP / GFP / HcRed, 범위 (1) : 350-390 nm의 , 460-488 nm의 495 nm의 / 500-557 nm의 분할; 범위 : 3 : 범위 2, 여기 파장은 395 nm의 / 402-448 nm의 분할 567-602 nm의, 무한에 610 nm의 / 615 nm의 분할 (20) 로다 민, 범위를. : 540-552 나노 미터는) 배출 575-640 nm의 560 nm의 분할.
- 스틸 및 전하 결합 장치 비디오 카메라를 사용하여 모션 픽처를 기록하고 상기 오프 - 라인 분석을 위해 컴퓨터의 하드 디스크에 저장한다.
- 다른 목표 (2.5 배, NA (개구 수) = 챔버의 파노라마 뷰 0.06을 사용하여, 5 배를,NA = 0.16; 10 배, NA는 0.32 =; 20 배, NA는 0.50 =; 관심있는 지역의 레코딩을위한 50X, NA = 0.55).
- 거의 동일 높이, 즉, 근위, 중앙, 대부분의 원격 혈관 유입 (그림. 3 층)에서 단역의 세 가지 영역으로 챔버의 창을 통해 볼 수있는 플랩 표면을 나눕니다. 화상 취득, 각 관찰 시점에서 다음과 같은 방법으로 진행 :
- 5 배 목표를 사용하여 원위하는 근위부에서 챔버의 창에서 이미지로 조직 이미지를 스캔합니다.
- 플랩의 각 영역에서 쉽게 식별 분기 패턴 2 ~ 또는 3 차 동맥과 동반 세정맥을 선택합니다. 5X, 10X, 20X 또는 목적을 사용하여, 용이하게 전체의 관찰 기간 내내 번들을 재 지역화 위해 arteriolovenular 번들의 출력물을 만든다.
- 20X의 목적, 50X 목표, 더 기록 5-6 모세관 필드와 "세포 사멸로각각 플랩의 지역 당 "필드. 10 배와 20 배 목표에 기록 된 모든 이미지는 녹색 빛 (로다 민) 필터, 반면, 5 배 및 50 배 목적 사용 푸른 빛 (형광 덱스 트란)과 흰색 빛 (Bisbenzimide) 필터로 촬영 한 이미지를 각각 푸른 빛 (형광 덱스 트란) 등을 사용 .
기록 된 데이터의 분석 (3)
NOTE : 29는 다음과 같이 컴퓨터 보조 화상 분석 시스템의 사용은 오프라인으로 기록 된 모든 파라미터를 수치화하여.
- 의 면적의 측정 비 관류 각각 괴사 조직 (mm 2).
- (2.6.1)에서 5 배 목적으로 기록 된 완전한 스캔 챔버 창 이미지와 비 관류 각각 괴사 조직을 측정 할 수있는 형광 덱스 트란을 사용합니다. 비 관류 영역의 경계와 m의 면적을 계산 : 비 관류 어두운 영역을 측정하기 위해 "AreaBo"기능을 사용하여소프트웨어의 면적 측정 알고리즘을 이용하여 m이.
- 동맥, 모세 혈관과 소정맥 (μm의)에서 미세 혈관 직경의 측정.
- 기록 된 AV-번들 또는 소프트웨어에 모세관 필드에서로드 비디오 또는 사진. 최상의 결과 가장 높은 배율 스틸 또는 비디오를 사용하기 위해 선박의 명확한 경계를 명확하게 볼 수있는 곳.
- 측정은 혈관의 벽에 수직 수행하고 있는지 확인하기 위해 소프트웨어의 "DiamPe"기능을 사용합니다. 이를 위해 그렇게 용기의 수직 직경 혈관의 벽에 세 번째 클릭 표시가있는 두 점을 표시합니다. 소프트웨어에 μm의 측정을 수행한다.
- 같은 장소에서 모든 레코딩을위한 동일한 선박에 대한 측정을 반복합니다. 평균 직경을 축적하는 복수의 모세관을 측정한다.
- 소동맥에서 적혈구 (RBC) 속도의 분석, 모세 혈관ND 세정맥 (mm / 초).
- 세동맥 적혈구 (RBC)를 들어 속도 (mm / s) 측정 소프트웨어 "VeloLSD"기능을 사용하여 직경이 측정되고있는 형광 덱스 트란 창 같은 혈관을 선택한다.
- 시간 (초)에 걸쳐 개별적인 혈관 계조 패턴의 시프트 (mm)의 측정을 기초로 선 시프트 법을 이용하여 컴퓨터 보조 화상 분석 장치로 분석한다.
- 용기의 체적 혈류 (PL / 초)의 측정.
- RBC 속도 및 용기 단면적의 세동맥, 세정맥과 모세 혈관의 용적 혈류 (PL / 초)를 계산한다 (π * R 2) 총과 Aroesty, 즉, Q는 = V * π * R (2)의 방정식에 따라 , 원통 형상 용기 (30)를 가정.
- RBC 관류 모세 혈관의 기능 모세 혈관 밀도의 측정 (영양 관류 : cm / cm 2).
- 소프트웨어에 20 배 목표 배율 기록 형광 모세관 필드를 넣습니다. RBC 관류 미세 혈관의 기능 모세 혈관 밀도를 측정하기 위해 "DensLA"기능을 사용합니다.
- 커서를 관류 모세 혈관을 추적하고 관류 혈관을 표시합니다. 표시하지 마십시오 모세 혈관, 소동맥 또는 세정맥 비 관류. 소프트웨어는 cm / cm 2의 관류 모세관 작용 모세관 밀도를 측정 할 것이다. 다른 기록 모세관 필드의 단계를 반복합니다.
- 미세 혈관 (미세 혈관 리모델링), 같은 꽃 봉 오리와 새싹-형성과 새로 형성된 미세 혈관 등의 혈관 신생의 초기 징후의 비틀림 측정.
- 로드 소프트웨어에 동영상이나 형광 모세관 필드의 프레임을 기록했다. gyrose 혈관을 확인하고 소프트웨어의 "TorqIx"기능을 사용합니다. 코스 명확한 혈관의 흐름을 추적하고 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭로 끝납니다. 소프트웨어 것직접적인 방법에 대한 직선을 그리고 추적 경로와 관계를 설정합니다.
참고 : 일반적으로 기존의 모세 혈관에서 수직으로 쏘아 같은 새싹, 콩나물, 새로 형성된 모세 혈관 등의 혈관 신생의 징후, 조심해. 단계 3.5에 기재된 바와 같이 이들 새로 형성된 혈관의 밀도를 측정한다.
- 로드 소프트웨어에 동영상이나 형광 모세관 필드의 프레임을 기록했다. gyrose 혈관을 확인하고 소프트웨어의 "TorqIx"기능을 사용합니다. 코스 명확한 혈관의 흐름을 추적하고 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭로 끝납니다. 소프트웨어 것직접적인 방법에 대한 직선을 그리고 추적 경로와 관계를 설정합니다.
- 핵 응축, 조각 및 / 또는 주변부의 (세포 / mm 2)와 같은 세포 사멸 세포 사멸에 대한 특성, 식별.
- 소프트웨어에 Bisbenzimide - 녹화 된 비디오 (50X 목표)을로드합니다. "DenseNA"기능을 사용합니다. 같은 왼쪽 버튼을 클릭 핵 응축, 분열과 주변부의 같은 언급 특성에 따라 세포 사멸을 표시합니다.
- 비디오 전반에 걸쳐 모든 특성 세포를 표시 한 후, 자동으로 모든 표시 셀을 계산하고, 지역 전체에 그것을 분할되는 소프트웨어에 "N / A"를 클릭합니다. 결과는 세포 사멸됩니다세포 / mm 2.
- 염증을 나타내는 혈관 내피 세포에 백혈구 부착 분석. 백혈구의 간헐적 준수 (백혈구 롤링, 준수 <30 초 : 롤러의 수 / mm 2 내피 세포의 표면)과 백혈구의 확고한 준수 (백혈구를 고집, 준수> 30 초 : 스티커 / mm 2의 혈관 내피 세포 표면의 수).
- 로다의 수를 카운트함으로써 염증 반응을 분석은 (<30 초, "롤러") ≥30 초 시간주기 ( "스티커")에 대해 포스트 모세관 세정맥의 내피 라이닝에 부착하는 백혈구와 간헐적으로 부착 백혈구 라벨링 . 세정맥 백혈구 준수는 mm 2 내피 세포 표면 당 세포로 표현된다.
- 미세 혈관 누출 (고분자 혈관 외 유출의 E = E1 / E2)의 매개 변수로 혈관 및 간질 그레이 레벨의 측정.
- 고분자 L 평가형광 덱스 트란의 정맥 주사 후 미세 혈관 투과성의 매개 변수로 eakage. Densitometrically 직접 모세 혈관 벽 (E1)에 인접뿐만 아니라 용기 (E2)의 한계 무 세포 혈장 조직에서 여러 계조를 결정한다. 이어서 E1 / E2 (31)의 비율과 같은 거대 분자 혈관 외 유출 (E)를 계산한다.
4. 수술 후 케어
- 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사를 방지하기 위해 별도의 케이지에 동물을 돌려줍니다. 이 흉골 드러 누움을 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 두지 마십시오. 출혈, 지역 및 감염의 전신 증상과 챔버의 위치를 매일 동물을 모니터링합니다.
- 드레싱 및 자동 절단에 운동 활동, 체중, 고통의 징후, 공차를 관찰함으로써 동물의 일반적인 상태를 평가한다.
- 무투을 피하기 위해 케이지 당 마우스를 유지챔버의 알 조작. 고통의 흔적에서, 8 시간 간격으로 피하, 0.05-0.1 ㎎ / ㎏ BW의 용량 프레 놀핀을 적용합니다.
5. 안락사와 피하 지방 상공 회의소의 외식
- 10 일에, 마취약 (150 ㎎ / ㎏ 펜 토바 비탈)의 과다 복용을 이용하여 동물을 희생.
- 챔버를 제거하고 면역 및 분자 단백질 분석에 대한 플랩 조직 샘플. 기존의 조직학 (포르말린) 및 정량화 단백질 분석 (액체 질소 나 드라이 아이스)의 샘플 조직.
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결과
괴사
이 모델의 주요 포인트 - 조직 괴사 다음 플랩 고도 (즉, 영구 급성 허혈 유도) - 반복적으로 측정하고, 10 일의 기간에 걸쳐도 3에 도시 된 바와 같이, 거시적으로 도시. 플랩 괴사의 최종 경계는 보통 수술 후 5 일째와 7 사이에 발생도. 3D-F (근위 중요하고 플랩의 말단 괴사 영역 사이에 개발, 혈관 확장 및 미세 혈관 리모델링의 빨간색 무늬, 즉, 영역 특징 ). 웰 관류 근위, 인터 비판적 관류 중앙 영역과 괴사 단역 (도 3F.) : 무 처리 대조군 마우스는 일반적으로 세 가지 영역으로 분할 될 수 십일 후 약 50 %의 괴사 면적을 개발한다. 서론에서 언급 한 바와 같이 우리 그룹의 이전 연구는, 보호 E를 보여 주었다플랩의 말단 영역으로 중앙 영역에서 비판적으로 관류 영역의 변화 특징으로 다른...
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토론
임상 결과 허혈성 합병증을 감소시켜 개선하기 위해, 비판적으로 관류 플랩 조직의 병태 생리 학적 과정의 자세한 지식이 필요합니다. 급성 허혈 영구 모방 새로운 동물 모델의 개발 따라서 필수적이다. 따라서, 우리는 샘플링 플랩 조직의 면역 조직 화학 및 분자 분석과 상관 될 수 근육 및 피부 맥관계의 다양한 파라미터의 반복적 형태학 다이나믹 및 기능적 실시간 평가를 허용 쉽고 신뢰성 있고, 재현성있는 모델을 개발할 수 있었다.
연습과 약간의 손재주가 필요하지만 수술은, 특정 수술 기술을 필요로하지 않습니다. 약 25 ~ 30 운영 동물의 학습 곡선이 제대로 등쪽 피하 지방 챔버와 플랩 준비의 장착을 마스터하는 것이 필요하다. 경험이 풍부한 손에, 수술 평균 35분 시간. 결정적인플랩 준비 단계는 정확한 위치 및 개요 주요 혈관의 정확한 위치와 챔버의 윈도우의 중앙에 플랩 (트랜스 조명을 사용)으로 횡단 할 및 panniculus의 카르노 서스 상기 젤라틴 형 층의 세심한 제거를...
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감사의 글
우리는 이미지 편집을위한 카타리나 Haberland 감사합니다. 자금 조달 : 수석 저자는 새로운 연구 실험실을 설정 뮌헨 공과 대학교에서 KKF 그랜트를 받았다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| C57Bl/6 마우스, 6-8 w, 20-22 g | Charles River | ||
| 탈모 크림 | Balea | 모든 탈모 크림 | |
| 티타늄 챔버 | Irola | 160001 | Halteblech M |
| 맞춤형 플렉시 유리 장착 프레임 | 동물의 호흡으로 인한 챔버 이동을 피하기 위해 챔버를 고정하는 프레임. | ||
| 슬롯 치즈 머리 나사 | , 나사 및 기타 | 842210 | DIN84, M2x10 |
| 육각 전체 너트 | 나사 및 기타 | 93422 | DIN934 M2 |
| 스냅 링 | Schaefer-Peters | 472212 | DIN472 J12x1,0 |
| 커버 유리 | Volab | 맞춤형 커버 유리, 직경 11.8mm. | |
| 고정 폼 | tesamoll | 05559-100 | tesamoll 표준 I-Profile |
| 케타민 염산염 | Parke Davis | Ketavet® | |
| Dihydroxylidinothiazine 염산염 | Bayer | Rompun® | |
| Buprenorphin | Essex Pharma | Temgesic® | |
| 식염수 0.9 % | |||
| 소독 알코올 | |||
| Vicryl 5-0 | Ethicon | V 490 H | |
| Ethilon 5-0 | Ethicon | EH 7823 H | |
| 1 ml 주사기 | |||
| 유연한 통치자가있는 수술 용 피부 마커 | 보라색 외과 | PS3151 | 모든 수술 피부 마커 및 유연한 통치 |
| 뾰족한 가위 | |||
| 마이크로 가위 | |||
| 일반 가위 | |||
| 2 클램프 | |||
| 미세 해부학 집게 | |||
| 마이크로 집게 | |||
| 육각 너트 드라이버 | wiha | 1018 | |
| 스크루 드라이버 | wiha | 685 | |
| 스냅 링 플라이어 | Knipex | 4411J1 | 12-25 mm |
| 와이어 커터 | Knipex | 70 02 160 | 와이어 커터는 나사를 짧게 자르는 데 사용됩니다. 160 mm |
| 트랜스 일루미네이션 라이트 | IKEA | 501.632.02 | LED 라이트 Jansjö; 모든 라이트 |
| 확대경 | |||
| Intravital 현미경 | Zeiss | 490035-0001-000 | Scope.A1.Axiotech |
| LED 시스템 | Zeiss | 423052-9501-000 | Colibri.2 |
| LED 모듈 365nm | Zeiss | 423052-9011-000 | |
| LED 모듈 470nm | Zeiss | 423052-9052-000 | |
| LED 모듈 540-580nm | Zeiss | 423052-9121-000 | |
| 필터 세트 62 62 HE BFP + GFP + HcRed | Zeiss | 489062-9901-000 | 범위 1: 350-390 nm 여기 파장, 분할 395 nm / 402-448 nm; 범위 2: 460-488 nm, 분할 495 nm / 500-557 nm; 범위 3: 567-602 nm, 분할 610 nm / 615 nm에서 무한대. |
| 필터 세트 20 Rhodamine | Zeiss | 485020-0000-000 | 540-552 nm, 분할 560 nm, 방출 575-640 nm |
| 2.5X 대물렌즈 NA=0.06 | Zeiss | 421020-9900-000 | A-Plan 2.5X/0.06 |
| 5X 대물렌즈 NA=0.16 | Zeiss | 420330-9901-000 | EC Plan-Neofluar 5X/0.16 M27 |
| 10X objetive NA=0.30 | Zeiss | 420340-9901-000 | EC Plan-Neofluar 10X/0.30 M27 |
| 20X 대물렌즈 NA=0.50 | Zeiss | 420350-9900-000 | EC Plan-Neofluar 20X/0.50 M27 |
| 50X 대물렌즈 NA=0.55 | Zeiss | 422472-9960-000 | LD Epiplan-Neofluar 50X/0.55 DIC 27 |
| ZEN 이미징 소프트웨어 | Zeiss | ZenPro 2012 | |
| CapImage | Dr. Zeintl | ||
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | 45946 | |
| bisBenzimide H 33342 trihydrochloride | Sigma-Aldrich | B2261 | 삼키면 유해함; 심한 피부 화상 및 눈 손상을 일으키고 호흡기 자극을 유발할 수 있음. |
| 로다 민 6G 클로라이드 | Invitrogen | R634 | 삼키면 유해하며, 유전적 결함을 유발할 수 있으며, 암을 유발할 수 있으며, 생식 능력이나 태아에게 해를 끼칠 수 있습니다. |
| 펜토바르비탈 | 메리알 | 나르코렌® |
참고문헌
- McFarlane, R., De Young, G., Henry, R. The design of a pedicle flap in the rat to study necrosis and its prevention. Plast Reconstr Surg. 35, 177-182 (1965).
- Finseth, F., Cutting, C. An experimental neurovascular island skin flap for the study of the delay phenomenon. Plast Reconstr Surg. 61, 412-420 (1978).
- Petry, J. J., Wortham, K. A. The anatomy of the epigastric flap in the experimental rat. Plast Reconstr Surg. 74, 410-413 (1984).
- Achauer, B. M., Black, K. S., Litke, D. K. Transcutaneous PO2 in flaps: a new method of survival prediction. Plast Reconstr Surg. 65, 45-45 (1980).
- Vollmar, B., Menger, M. D. Assessment of microvascular oxygen supply and tissue oxygenation in hepatic ischemia/reperfusion. Adv. Exp. Med. Biol. 428, 403-408 (1997).
- Menger, M. D., Barker, J. H., Messmer, K. Capillary blood perfusion during postischemic reperfusion in striated muscle. Plast Reconstr Surg. 89, 1104-1114 (1992).
- Uhl, E., Rösken, F., Curri, S. B., Menger, M. D., Messmer, K. Reduction of skin flap necrosis by transdermal application of buflomedil bound to liposomes. Plast Reconstr Surg. 102, 1598-1604 (1998).
- Pang, C. Y., Neligan, P., Nakatsuka, T., Sasaki, G. H. Assessment of the fluorescein dye test for prediction of skin flap viability in pigs. J Surg Res. 41, 173-181 (1986).
- Hjortdal, V. E., Hansen, E. S., Henriksen, T. B., Kjolseth, D., Soballe, K., Djurhuus, J. C. The microcirculation of myocutaneous island flaps in pigs studied with radioactive blood volume tracers and microspheres of different sizes. Plast Reconstr Surg. 89, 116-122 (1992).
- Pang, C. Y., Neligan, P., Nakatsuka, T. Assessment of microsphere technique for measurement of capillary blood flow in random skin flaps in pigs. Plast Reconstr Surg. 74, 513-521 (1984).
- Sandison, J. C. A new method for the microscopic study of living growing tissues by the introduction of a transparent chamber in the rabbit's ear. The Anatomical Record. 28, 281-287 (1924).
- Algire, G. H. An Adaptation of the Transparent-Chamber Technique to the Mouse. Journal of the National Cancer Institute. 4, 1-11 (1943).
- Lehr, H. A., Leunig, M., Menger, M. D., Nolte, D., Messmer, K. Dorsal skinfold chamber technique for intravital microscopy in nude mice. Am J Pathol. 4, 1055-1062 (1993).
- Barker, J. H., et al. An animal model to study microcirculatory changes associated with vascular delay. Br J Plast Surg. 52, 133-142 (1999).
- Erni, D., Sakai, H., Banic, A., Tschopp, H. M., Intaglietta, M. Quantitative assessment of microhemodynamics in ischemic skin flap tissue by intravital microscopy. Ann Plast Surg. 43, 405-414 (1999).
- Roesken, F., Schäfer, T., Spitzer, W. J., Vollmar, B., Menger, M. D. In vivo analysis of the microcirculation of osteomyocutaneous flaps using fluorescence microscopy. Br J Plast Surg. 52, 644-652 (1999).
- Harder, Y., Amon, M., Erni, D., Menger, M. D. Evolution of ischemic tissue injury in a random pattern flap: a new mouse model using intravital microscopy. J Surg Res. 121, 197-205 (2004).
- Harder, Y., Contaldo, C., Klenk, J., Banic, A., Jakob, S. M., Erni, D. Preconditioning with monophosphoryl lipid A improves survival of critically ischemic tissue. Anesth Analg. 100, 1786-1792 (2005).
- Rezaeian, F., et al. Erythropoieton protects critically perfused flap tissue. Ann Surg. 248, 919-929 (2008).
- Harder, Y., et al. Erythropoietin reduces necrosis in critically ischemic myocutaneous tissue by protecting nutritive perfusion in a dose-dependent manner. Surgery. 145, 10-1016 (2009).
- Rezaeian, F., et al. Erythropoietin-induced upregulation of endothelial nitric oxide synthase but not vascular endothelial growth factor prevents musculocutaneous tissue from ischemic damage. Lab Invest. 90, 40-51 (2010).
- Rezaeian, F., Ong, M. F., Harder, Y., Menger, M. D. N-acetylcysteine attenuates leukocytic inflammation and microvascular perfusion failure in critically ischemic random pattern flaps. Microvasc Res. 82, 28-34 (2011).
- Rezaeian, F., et al. Ghrelin protects musculocutaneous tissue from ischemic necrosis by improving microvascular perfusion. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302, 603-610 (2012).
- Rezaeian, F., et al. Long-term preconditioning with Erythropoietin reduces ischemia-induced skin necrosis. Microcirculation. , (2013).
- Harder, Y., et al. Heat shock preconditioning reduces ischemic tissue necrosis by heat shock protein (HSP)-32-mediated improvement of the microcirculation rather than induction of ischemic tolerance. Ann Surg. 242, 869-878 (2005).
- Tobalem, M., et al. Local shockwave-induced capillary recruitment improves survival of musculocutaneous flaps. J Surg Res. 184, 1196-1204 (2013).
- Lindenblatt, N., Calcagni, M., Contaldo, C., Menger, M. D., Giovanoli, P., Vollmar, B. A new model for studying the revascularization of skin grafts in vivo: the role of angiogenesis. Plast Reconstr Surg. 122, 169-1680 (2008).
- Schweizer, R., et al. Morphology and hemodynamics during vascular regeneration in critically ischemic murine skin studied by intravital microscopy techniques. Eur Surg Res. 47, 222-230 (2011).
- Klyscz, T., Jünger, M., Jung, F., Zeintl, H. Cap image—a new kind of computer-assisted video image analysis system for dynamic capillary microscopy. Biomed. Tech. 42, 168-1675 (1997).
- Gross, J. F., Aroesty, J. Mathematical models of capillary flow: a critical review. Biorheology. 9, 225-264 (1972).
- Menger, M. D., Pelikan, S., Steiner, D. Microvascular ischemiareperfusion injury in striated muscle: significance of ‘reflow paradox. Am J Physiol. 263 (6 part 2), 1901-1906 (1992).
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