Um<em> In Vitro</em> Modelo para o Estudo da Cellular Fisiopatologia em Globóides Leucodistrofia celular
Summary
Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.
Abstract
A função precisa da microglia multi-nucleadas, chamados de células Globóides, que são excepcionalmente abundantes no sistema nervoso central de leucodistrofia celular globoso (GLD) é incerto. Esta lacuna no conhecimento tem sido dificultada pela falta de um adequado modelo in vitro para o estudo. Relata-se um sistema de cultura glial murino primário em que o tratamento com resultados psicosina em multinucleações de microglia semelhantes às células Globóides características encontradas em GLD. Usando este novo sistema, que definiu as condições e modos de análise para o estudo de células Globóides. O potencial de uso deste sistema modelo foi validado em nosso estudo anterior, que identificou um papel potencial para metaloproteinases da matriz (MMP) -3 em GLD. Este novo sistema in vitro pode ser um modelo útil para estudar a formação e função, mas também a manipulação terapêutica potencial, destas células únicas.
Introduction
Leucodistrofia celular Globóides (GLD), também conhecida como doença de Krabbe, é uma doença desmielinizante fatal, resultante da perda de mutações de função no galatocerebrosidase (GalC) do gene 1. A forma mais prevalente de GLD é a variante infantil que se caracteriza por início na infância e caracteriza-se por um curso clínico agressivo do motor e do declínio cognitivo, levando à morte prematura, muitas vezes antes dos cinco anos de idade 2,3. O teste genético é utilizado para verificar o diagnóstico de GLD 4. Neuropatologia da GLD revela desmielinização generalizada, atrofia neuronal, astrogliosis e presença de microglia multi-nucleadas ingurgitadas chamadas células Globóides 5-7. A identificação de células Globóides, muitas vezes contendo inclusões tubulosas no seu citoplasma, tem sido uma característica de definição de GLD para os últimos 97 anos, embora a função específica destas células visíveis tem permanecido elusiva.
A participação das organizações não-myelinating glia (microglia e astrócitos) na patogênese da GLD tem sido considerada uma resposta secundária à profunda desmielinização nesta doença 8. Curiosamente, a primeira descrição da doença, feita por Knud Krabbe em 1916 5, formação relatado dos fagócitos multinucleadas contendo detritos lipídica que foram nomeados 'Globóides células "e são uma característica desta doença.
Células Globóides são a característica marca de GLD patologia, apesar de seu papel na GLD tem sido ignorado. Curiosamente, estas células estão entre as primeiras alterações características no tecido do SNC de GLD. Esta falta de conhecimento pode ter sido devido à suposição de que a formação de fagócitos multinucleadas, chamadas de células gigantes em outras doenças, são normalmente considerados como uma consequência de uma patologia, em vez de uma força motriz patogénico inicial 9. Portanto, há poucos estudos sobre os mecanismos pelos whicélulas Globóides ch são formados a partir de fagócitos, em particular no sistema nervoso central de GLD. O procedimento descrito no presente relatório centra-se na importância da formação de células Globóides no SNC e nossa manifestação anterior que multinucleações induzida por psicosina de microglia in vitro e essas células apresentaram níveis mais altos de atividade fagocitária. Consistente com essas observações, as células Globóides em cérebros Twitcher contêm freqüentemente detritos PAS-positivo, sugerindo níveis elevados de atividade fagocitária. Células Globóides também são encontrados para ser imunopositivas para ferritina (um marcador de microglia) 10, KP-1 / CD68 (um marcador de monócitos), e alguns também são positivas para vimentina (uma proteína intermediária filamento e marcador de astrócitos e microglia ativada) 11, HLA-RDa (um receptor da superfície MHCII), e TNF-α 7, e Iba-1 (uma proteína de ligação de cálcio utilizado para identificar microglia) 12. Com base neste conjunto de marcadores, células Globóides originam de microglia que desenvolvemum fenótipo original.
Apesar de sua singularidade, a função ea contribuição dos GCs para GLD patogênese específica tem sido largamente ignorado. Células Globóides ter sido pensado para ser uma consequência secundária de desmielinização crônica. No entanto, estudos anteriores examinaram a relação temporal de células Globóides para a patologia da substância branca de GLD identificaram a presença de células no final do Globóides embrionário para períodos de pós-natais; tempos que precederam a apoptose de oligodendrócitos e desmielinização evidente 13. Assim, a sequência temporal do desenvolvimento da neuropatologia no GLD sugere que as células Globóides são formadas antes da desmielinização nesta doença 14. Isto levou a nossa hipótese de que o início da formação de células Globóides em GLD pode representar um evento patogénico definindo, em vez de, uma resposta secundária a danos reactivo oligodendrócitos 15. Além disso, a desregulação da atividade da microglia em GLD tem sido considerado um factor limitando a sua eficácia a longo prazo da terapia de células estaminais hematopeotic para tratar esta doença 16. Assim, investigando as funções celulares e regulação da microglia e células Globóides, em resposta a psicosina deverá fornecer novos insights na patogênese da GLD.
Até recentemente, a falta de um modelo adequado para estudar a formação de células globoso limitou a compreensão da função e contribuição exacta destas células para a patologia de GLD. Em estudos recentes, foi determinado que as células-Globóides como pode ser formado em resposta directa a Psicosina, uma toxina lípido patogénico que se acumula em GLD. Descobrimos que a microglia, mas não macrófagos, são activadas e transformado em células Globóides em culturas gliais primários, em resposta a Psicosina 15. Esta transformação em células Globóides foi encontrado para ser mediada pela protease extracelular, as metaloproteinases de matriz (MMP) -3 15. Mais recentemente,estenderam estas conclusões e determinou que microglia e Globóides células ativadas por psicosina desenvolvidos neste sistema in vitro modelo são potencialmente tóxicos para os oligodendrócitos e as células progenitoras de oligodendrócitos. Assim, quando considerado no contexto de GLD, a acumulação inicial de psicosina e formação de células Globóides anteriores à desmielinização apoiam um papel patogénico primário e eventualmente em microglias emergente para esta doença.
Propomos que o estudo da formação de células Globóides irá revelar novas informações sobre a patogenia da GLD que irá contribuir para a nossa compreensão da doença. Além disso, esse novo modelo de celular da GLD pode fornecer um novo formato a partir do qual novas abordagens terapêuticas para lidar com alterações patológicas esta doença poderia ser testada. Assim, neste relatório nós fornecemos um protocolo detalhado para o desenvolvimento in vitro de células Globóides induzida por psicosina de culturas primárias de células da glia não myelinating.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo aqui descrito fornece um novo sistema modelo para estudar o desenvolvimento e caracterização funcional de microglia ativados e células Globóides. Trabalhos anteriores por Im et al. utilizando uma linha celular HEK293 fornecido um modelo para o desenvolvimento do presente protocolo para o estudo da formação de células globoso 21. É também importante salientar que as células derivadas Globóides no modelo diferem das células nativas Globóides identificáveis em GLD. Por ex…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by grants from the National Multiple Sclerosis Society (RG 5001-A-3 to S.J.C.), the National Institutes of Health (NS065808 to E.R.B.; NS078392 to S.J.C.), start-up funds from the UConn Health Center (to SJC) and the Kim Family Fund (UCHC in support of K.I.C.).
Materials
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing no cations (Mg2+ and Ca2+). | Life technologies | 14175-095 |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi | 130-092-628 |
| 40 uM cell-strainer | Fisherbrand | 22363547 |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing cations (Mg2+ and Ca2+). | Gibco | 14025-092 |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 |
| fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 |
| Penicilin/Streptomycin | Life technologies | 15070-063 |
| Laminin | Sigma | L2020 |
| Trypsin-EDTA solution | Life technologies | 25299-056 |
| Psychosine | Sigma | P9256 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 19208 |
| Normal Goat Serum (NGS) | Invitrogen | PCN5000 |
| Iba-1 | WAKO | 019-19741 |
| Alexa Fluor conjugated antisera | Life Technologies | Various |
| Mounting Media | Southern Biotech | OB100-01 |
| Phagocytic Assay Kit | Cayman Chemicals | 500290 |
| HEPES | Sigma | BP310-500 |
References
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