Imagens em tempo real de células mielóides em Dynamics<em> Apc<sup> Min / +</sup</em> Intestinal Tumores girando Disk microscopia confocal
Summary
By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.
Abstract
Células mielóides são as células do sistema imunológico mais abundantes e dentro de tumores têm sido mostrados para promover a progressão do tumor. Técnicas de imagem intravital modernos permitem a observação do comportamento celular ao vivo dentro do órgão, mas pode ser um desafio em alguns tipos de câncer devido ao órgão e tumor acessibilidade, tais como intestino. A observação direta de tumores intestinais não foi previamente relatado. Um procedimento cirúrgico descrito aqui permite a observação direta da dinâmica de células mielóides dentro dos tumores intestinais em ratos vivos, utilizando camundongos transgênicos repórter fluorescente e traçadores injectáveis ou anticorpos. Para este propósito, um de quatro cores, multi-região, com lentes de micro-disco giratório microscópio confocal que permite imagens contínuo a longo prazo com a aquisição de imagem foi usada rápida. Apc Min / + ratinhos que desenvolvem adenomas múltiplos do intestino delgado são cruzados com ratos c-fms-EGFP para visualizar as células mielóides e com camundongos ACTB-ECFPpara visualizar as células epiteliais do intestino das criptas. Procedimentos para a marcação de diferentes componentes, tais como tumores, vasos sanguíneos e neutrófilos, e o processo para o posicionamento do tumor para a imagiologia por meio a superfície serosa também são descritos. Filmes time-lapse compilados a partir de várias horas de imagens permitem que a análise do comportamento de células mielóides in situ no microambiente intestinal.
Introduction
Evidência esmagadora demonstra agora que o microambiente do tumor, consistindo em populações celulares heterogéneas, incluindo fibroblastos, células endoteliais, células imunitárias e inflamatórias, matriz extracelular e factores solúveis, desempenha um papel crucial na iniciação e progressão de tumores sólidos, contribuindo para quase todos características de câncer 1. Com efeito, durante a progressão do tumor, há interações dinâmicas constantes entre as células cancerosas transformadas e células do estroma que evoluem para gerar um microambiente favorável à malignidade 2. Entre as células do sistema imunológico que se infiltram no microambiente do tumor, as células mielóides são os mais abundantes 3. Consistindo de macrófagos associados a tumores (TAM), células supressoras derivadas de mielóides (MDSCs), células dendríticas (DC) e de neutrófilos (PMNs), as células mielóides são recrutadas a partir da medula óssea e infiltrar progressivamente tumores, libertando citocinas, factores de crescimento e proteases que pode promovercrescimento do tumor e se espalhar 4. A interferência entre células cancerosas e células mielóides é complexo, mas dinâmico. Assim, a compreensão da natureza de suas interações é crucial para determinar por que essas células promovem a progressão do câncer, em vez de participar de uma resposta imune anti-tumor, e pode ajudar a encontrar novos alvos para controlá-lo.
A observação direta por microscopia intravital fornece informações sobre a dinâmica de células dentro dos tecidos de camundongos ao vivo 5. A quatro cores, multi-região, disco giratório com lentes micro-sistema confocal foi projetado para estudar células estromais dentro de tumores mamários 6. Esta abordagem permite a imagiologia contínua a longo prazo e inclui várias vantagens, tais como: (a) de aquisição de imagens rápidas para minimizar artefactos de movimento, (b), a anestesia de longo prazo, (c) quatro aquisição de cor a seguir diferentes tipos de células, (d) marcação fluorescente de diferentes componentes tumorais, e (e) a observação de diferentes microambientes tumorais sagacidadehin o mesmo mouse para evitar mouse para variabilidade rato 7-9. Com esta tecnologia, os diferentes comportamentos de células têm sido relatados no vírus do tumor mamário de modelo (MMTV) polioma meio conduzido pelo promotor T oncogene (Pymt) que mostra as fases progressivas da tumorigénese. Os linfócitos T reguladoras (Treg, visualizadas pelo transgene Foxp3 EGFP) migram preferencialmente na proximidade dos vasos sanguíneos que o DCS (CD11c-DTR-EGFP), fibroblastos associada a carcinoma (FSP1 + / + -EGFP) e células mielóides (c-fms -EGFP) exibem maior mobilidade na periferia do tumor do que no interior da massa do tumor. Na condição de hipóxia sistémica aguda, as células migraram de forma diferente: Tregs parar a migração em contraste com as células mielóides que continuam a mover-se 6. Além disso, no mesmo modelo de rato, demonstrou-se que as alterações de sensibilidade com doxorrubicina fase do tumor, a distribuição da droga está relacionada com a resposta a fármacos, e doxorrubicinatratamento conduz ao recrutamento dependente de CCR2 de células mielóides ao tumores. Assim, imagens ao vivo também pode ser usado para obter insights sobre as respostas de drogas no local e na biologia do chemoresistance 10,11.
Polipose adenomatosa coli (APC) mutações genéticas ocorrem geralmente em adenomas colorretais humanos e carcinomas 12 e mutação de uma única cópia dos resultados gene APC em polipose adenomatosa familiar (FAP), o que confere um risco extremamente elevado para câncer de cólon 13. A estirpe de ratinhos Apc Min / + carrega uma mutação no códon 850 truncamento do gene APC e desenvolve espontaneamente várias adenomas intestinais em todo o intestino delgado de 14 16. Imagens intravital longo prazo do intestino é difícil por causa da capacidade de invasão do procedimento, uma vez que a abertura da cavidade peritoneal, é necessária para o acesso ao intestino. Imagens ao vivo de curto prazo ruaudies ter sido previamente publicada no intestino saudável 17,18, mas a observação direta de longo prazo de tumores intestinais não foi relatado. Um procedimento cirúrgico foi concebido e aperfeiçoado para visualizar tumores através da superfície serosa do intestino, usando o sistema de microscopia intravital fiação disco previamente utilizado para tumores mamários 6,10 imagem. Neste artigo, é descrito um protocolo que permite que se siga o comportamento de células mielóides no interior dos tumores do intestino delgado, utilizando Apc Min / + mice.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste trabalho, um protocolo detalhado é descrito por disco giratório de imagem confocal da dinâmica de células mielóides em tumores intestinais por várias horas em um animal vivo, fotografada do lado da serosa do intestino.
Para evitar a inflamação e a ter condições fisiológicas óptimas, a imagiologia do intestino tem que ser feito no órgão intacto. No entanto, a imagem do lado da serosa do intestino é difícil, uma vez que a luz tem de passar através de diferentes camadas d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer Ying Yu para APC Min / + camundongos genotipagem. Este estudo foi apoiado por fundos do INSERM e subvenções (CA057621 e AI053194) do National Institutes of Health.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| ApcMin/+ mice | Jackson Laboratory | 2020 | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 3773 | |
| cfms-EGFP mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| 2,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated | Invitrogen | D7139 | |
| Isoflurane | Butler Animal Health Supply | 29450 | |
| Nitrogen | UCSF | ||
| Oxygen | UCSF | ||
| 1X PBS | UCSF cell culture facility | ||
| Saline Buffer | UCSF cell culture facility | ||
| Anti-mouse Ly-6G (GR1) antibody AF647 | UCSF Monoclonal antibody core | Stock 1mg/ml. Use at 7ug/mouse | |
| Atropine | LARC UCSF | Use at 1mg/Kg mouse | |
| Alcohol wipes | Becton Dickinson | 326895 | |
| 28G1/2 insulin syringe | Becton Dickinson | 329465 | |
| Remium cover glass | Fisher Scientific | 12-548-5M | 24×50-1 |
| Superfrost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | 25x75x1mm |
| Krazy glue | Office Max | 7111555 | |
| Betadine | LARC UCSF | ||
| Heat blanket | Gaymar Industries | ||
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn ON 30min before use |
| Cotton tipped apllicators 6-inch | Electron Microscopy Sciences | 72310-10 | |
| Anesthesia system | Summit Anesthesia Support | ||
| Inverted microscope | Carl Zeiss Inc | Zeiss Axiovert 200M | |
| stage insert | Applied Sientific Instrumentation | ||
| Mouse Ox oximeter, software and sensors | Starr Life Sciences | MouseOx | |
| Nebulizer | Summit Anesthesia Support | ||
| Imaris | Bitplane | ||
| mManager | Vale lab, UCSF | Open-source software | |
| ICCD camera | Stanford Photonics | XR-Mega-10EX S-30 | |
| Spinning disk confocal sacan-head | Yokogawa Corporation | CSU-10b |
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