Summary

Echtzeit-Imaging von myeloischen Zellen in Dynamics<em> Apc<sup> Min / +</sup</em> Darmtumoren durch Spinning-Disk-konfokale Mikroskopie

Published: October 06, 2014
doi:

Summary

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

Abstract

Myeloide Zellen sind die am häufigsten vorkommenden Immunzellen in Tumoren und haben gezeigt, dass Tumorprogression zu fördern. Moderne bildgebende Verfahren ermöglichen Intravital die Beobachtung von lebenden Zellverhalten im Inneren der Orgel, sondern kann eine Herausforderung in einigen Arten von Krebs durch Orgel und Tumor Zugänglichkeit sein wie Darm. Die direkte Beobachtung von Darmtumoren wurde bisher nicht berichtet worden. Eine hier beschriebene chirurgische Verfahren ermöglicht die direkte Beobachtung der myeloischen Zelldynamik in den Darmtumoren in lebenden Mäusen mit Hilfe transgener Mäuse fluoreszierenden Reporter und injizierbare Tracer oder Antikörper. Zu diesem Zweck wird ein Vier-Farben-, Multi-Region, Mikrolinsen-Spinning-Disk konfokalen Mikroskop, die langfristige, kontinuierliche Bildgebung mit schneller Bildaufnahme ermöglicht wurde verwendet. Apc Min / + Mäusen, die mehrere Adenome im Dünndarm zu entwickeln sind gekreuzt mit c-fms-EGFP Mäuse myeloischen Zellen visualisieren und mit ACTB-ECFP Mäuseauf intestinalen Epithelzellen der Krypten zu visualisieren. Verfahren zur Markierung von verschiedenen Tumorkomponenten, wie Blutgefäße und Neutrophilen, und das Verfahren zum Positionieren des Tumors für die Bildgebung durch die Serosa-Oberfläche werden ebenfalls beschrieben. Zeitraffer-Filme von mehreren Stunden von bildgebenden zusammengestellt ermöglichen die Analyse von myeloischen Zellverhalten in situ in der Darmmikroumgebung.

Introduction

Überwältigenden Beweis zeigt nun, daß der Tumor-Mikroumgebung, die aus heterogenen Zellpopulationen, einschließlich Fibroblasten, Endothelzellen, Immun-und Entzündungszellen, extrazelluläre Matrix und lösliche Faktoren spielt eine entscheidende Rolle bei der Initiierung und Progression von soliden Tumoren, indem sie zu fast Kennzeichen von Krebs 1. Tatsächlich, während der Tumorprogression gibt es konstante dynamische Wechselwirkungen zwischen transformierten Krebszellen und Stromazellen, die eine Mikro günstig Malignität 2 erzeugen entwickeln. Zu den Immunzellen, die das Tumor-Mikroumgebung zu infiltrieren sind myeloischen Zellen die am häufigsten vorkommende 3. Bestehend aus Tumor-assoziierte Makrophagen (TAM), myeloische abgeleitete Suppressorzellen (MDSC), dendritische Zellen (DC) und Neutrophilen (PMN), werden Knochenmarkzellen aus Knochenmark gewonnen und fortschreitend zu infiltrieren Tumoren, Freisetzung von Zytokinen, Wachstumsfaktoren und Proteasen, fördern könnenTumorwachstum und zu verbreiten 4. Das Übersprechen zwischen den Krebszellen und myeloischen Zellen ist komplex, sondern dynamisch. Somit ist das Verständnis der Natur der Wechselwirkungen entscheidend für die Bestimmung, warum diese Zellen fördern Krebsentwicklung statt, die an einer Anti-Tumor-Immunantwort, und kann dazu beitragen, neue Ziele zu kontrollieren finden.

Direkte Beobachtung durch Intravitalmikroskopie liefert Informationen über Zelldynamik in den Geweben von lebenden Mäusen 5. Ein Vierfarben-, Mehrbereich, Mikrolinsen-Spinnplatte konfokales System wurde entwickelt, um Stromazellen in Brusttumoren 6 zu untersuchen. Dieser Ansatz ermöglicht die langfristige, kontinuierliche Bildgebung und umfasst mehrere Vorteile, wie (a) schnelle Bilderfassung, um Bewegungsartefakte zu minimieren, (b) langfristige Anästhesie, (c) vier Farberfassung auf verschiedenen Zelltypen zu folgen, (d) Fluoreszenzmarkierung verschiedener Tumorkomponenten, und (e) Beobachtung verschiedener Tumormikroumgebung witHin die gleiche Maus Maus Maus Variabilität 7-9 zu vermeiden. Mit dieser Technik wurden verschiedene Zellverhalten in dem Brusttumor-Virus (MMTV)-Promotor angetrieben Polyoma mittleren T-Onkogen (PyMT) Modell, das schrittweise von Tumorgenese zeigt gemeldet. Regulatorische T-Lymphozyten (Treg, von der Foxp3 EGFP-Transgens sichtbar) wandern bevorzugt in der Nähe der Blutgefäße in der Erwägung, DC (CD11c-DTR-EGFP), Karzinom-assoziierte Fibroblasten (Fsp1 + / + -EGFP) und myeloischen Zellen (c-fms -EGFP) weisen höhere Beweglichkeit in der Tumorperipherie als innerhalb der Tumormasse. Im Zustand der akuten systemischen Hypoxie, wanderten Zellen anders: Tregs stoppen Migration im Gegensatz zu myeloischen Zellen, die sich zu bewegen 6 fort. Zusätzlich wird in der gleichen Mausmodell wurde gezeigt, dass Doxorubicin Empfindlichkeitsänderungen mit Tumorstadium wird Arzneimittelverteilung Arzneimittelantwort und Doxorubicin bezogenenBehandlung führt zu CCR2-abhängigen Rekrutierung von myeloischen Zellen zu Tumoren. So können Live-Bildgebung auch verwendet, um Einblicke in die Arzneimittelreaktionen in situ und die Biologie der Chemoresistenz 10,11 zu gewinnen.

Adenomatöse Polyposis coli (APC)-Gen-Mutationen treten häufig in menschlichen kolorektalen Adenomen und Karzinomen 12 und Mutation eines einzelnen Kopie des Gens Ergebnisse von APC im familiären adenomatösen Polyposis (FAP), die ein extrem hohes Risiko für Darmkrebs 13 verleiht. Der Maus-Stamm Apc Min / + trägt eine Trunkierungsmutation an Codon 850 des APC-Gens und entwickelt spontan mehreren intestinalen Adenomen ganzen Dünndarm 14-16. Langfristige intravitalen Bildgebung des Darms ist schwierig, weil der Invasivität des Verfahrens, da das Öffnen der Bauchhöhle, die für den Zugriff auf den Darm. Kurzfristige Live-Bildgebung studies wurden zuvor an gesunden Darm 17,18 veröffentlicht, aber die langfristige direkte Beobachtung von Darmtumoren wurde nicht berichtet. Ein chirurgisches Verfahren wurde entwickelt und verfeinert, um Tumore über die serösen Oberfläche des Darms sichtbar zu machen, mit der sich drehenden Scheibe Intravitalmikroskopie System vorher auf Bild Brusttumoren 6,10 verwendet. In diesem Beitrag wird ein Protokoll beschrieben, das eine um das Verhalten von myeloischen Zellen in den Tumoren im Dünndarm unter Verwendung von Apc Min / +-Mäusen folgen können.

Protocol

HINWEIS: Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit Verfahren, die von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC), UCSF genehmigt durchgeführt. Alle Abbildungsexperimente waren Nichtlebens Verfahren und die Tiere unmittelbar nach dem Ende der Bildaufnahme getötet. 1. Generierung von Mäusen HINWEIS: APC Min / + Mäusen, die eine Mutation des APC-Gens auf, entwickeln spontan 50-100 Adenomen im Dünndarm. …

Representative Results

Durch die Verwendung von Spinnplatten konfokale Mikroskopie, nicht tumorale und Tumorgewebe im Dünndarm von Apc Min / +; ACTB-ECFP, c-fms-ECFP Mäuse aus der Serosa-Oberfläche dargestellt werden. Nach der Abbildung ist der Kamera-Software zur Analyse und Anpassung der Akquisition (Ergänzende Abbildung 1). Nach intravenöser (iv) Injektion von fluoreszierenden 2.000 kDa Dextran-Rhodamin und Ly-6G 647 konjugierte Antikörper, Blutgefäße und PMN kann detektiert werden <str…

Discussion

In diesem Beitrag wird ein detailliertes Protokoll für die drehende Scheibe konfokale Bildgebung von myeloiden Zelldynamik im Darmtumoren für mehrere Stunden in einem lebenden Tier, von der Serosa-Seite des Darm abgebildet beschrieben.

Um Entzündungen zu verhindern und eine optimale physiologische Bedingungen, Bildgebung des Darms hat auf die intakte Organ erfolgen. Allerdings ist aus der Abbildungs ​​Serosaseite Darm herausfordernd, da das Licht durch verschiedene Gewebeschichten, wi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir möchten Ying Yu für Apc Min / + Mäusen Genotypisierung danken. Diese Studie wurde durch Mittel aus INSERM und Zuschüsse (CA057621 und AI053194) von den National Institutes of Health.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
ApcMin/+ mice Jackson Laboratory 2020
ACTB-ECFP mice Jackson Laboratory 3773
cfms-EGFP mice Jackson Laboratory 18549
2,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated Invitrogen D7139
Isoflurane Butler Animal Health Supply 29450
Nitrogen UCSF
Oxygen UCSF
1X PBS UCSF cell culture facility
Saline Buffer UCSF cell culture facility
Anti-mouse Ly-6G (GR1) antibody AF647 UCSF Monoclonal antibody core Stock 1mg/ml. Use at 7ug/mouse
Atropine LARC UCSF Use at 1mg/Kg mouse
Alcohol wipes Becton Dickinson 326895
28G1/2 insulin syringe Becton Dickinson 329465
Remium cover glass Fisher Scientific 12-548-5M 24×50-1
Superfrost plus microscope slides Fisher Scientific 12-550-15 25x75x1mm
Krazy glue Office Max 7111555
Betadine LARC UCSF
Heat blanket Gaymar Industries
Hot bead sterilizer Fine Science Tools 18000-45 Turn ON 30min before use
Cotton tipped apllicators 6-inch Electron Microscopy Sciences 72310-10
Anesthesia system Summit Anesthesia Support
Inverted microscope Carl Zeiss Inc Zeiss Axiovert 200M
stage insert Applied Sientific Instrumentation
Mouse Ox oximeter, software and sensors Starr Life Sciences MouseOx
Nebulizer Summit Anesthesia Support
Imaris Bitplane
mManager Vale lab, UCSF Open-source software
ICCD camera Stanford Photonics XR-Mega-10EX S-30
Spinning disk confocal sacan-head Yokogawa Corporation CSU-10b

References

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Bonnans, C., Lohela, M., Werb, Z. Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (92), e51916, doi:10.3791/51916 (2014).

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