הדמיה של Dynamics התאים מיאלואידית בזמן אמת<em> Apc<sup> מינימום / +</sup</em> מעיים גידולים על ידי דיסק מסתובב Confocal מיקרוסקופית
Summary
By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.
Abstract
תאי מיאלואידית הם התאים חיסוניים הנפוצים ביותר בגידולים והוכחו לקדם התקדמות גידול. טכניקות הדמיה intravital מודרניות מאפשרות התצפית של התנהגות תאית חי בתוך האיבר אבל יכולות להיות מאתגר בסוגים מסוימים של הסרטן בשל נגישות איבר וגידול כגון מעי. תצפית ישירה של גידולים במעי לא דווחה בעבר. הליך כירורגי המתואר כאן מאפשר תצפית ישירה של דינמיקת תא מיאלואידית בתוך הגידולים במעיים בעכברים חיים באמצעות עכברי כתב ניאון מהונדסים וקליעים נותבים או נוגדנים להזרקה. לצורך כך, נעשה שימוש בארבעה צבעים, רב אזור, מיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב עם עדשות מיקרו, המאפשר הדמיה רציפה ארוך טווח עם רכישת תמונה מהירה. Apc מינימאלי עכברים / + המתפתחים אדנומות מרובות במעי הדק הם חצו עם עכברי c-FMS-EGFP לדמיין תאי מיאלואידית ועם עכברי ACTB-ECFPלדמיין תאי אפיתל במעי של מאורות. נהלים לתיוג רכיבי גידול שונים, כגון כלי דם ונויטרופילים, ואת ההליך למיצוב גידול הדמיה דרך פני השטח serosal גם מתוארים. זמן לשגות סרטים מלוקט מכמה שעות של הדמיה מאפשרים הניתוח של מיאלואידית התנהגות תא באתרו בmicroenvironment המעיים.
Introduction
ראיות מכריעות עכשיו מוכיחות כי microenvironment הגידול, בהיקף של אוכלוסיות תאים הטרוגנית, הכוללים פיברובלסטים, תאי אנדותל, תאי מערכת חיסונית ודלקתיים, מטריצת חוץ תאית, וגורמים מסיסים, ממלא תפקיד מכריע בייזום ובהתפתחות של גידולים מוצקים על ידי תרומה לכמעט כל סימני ההיכר של סרטן 1. ואכן, במהלך התקדמות גידול, יש אינטראקציות דינמיות מתמידים בין תאים סרטניים ותאי סטרומה הפכו להתפתח ליצור microenvironment חיובי לממאירות 2. בין תאי מערכת החיסון שלהסתנן microenvironment הגידול, תאי מיאלואידית הם בשפע 3 ביותר. בהיקף של מקרופאגים גידולים הקשורים (TAM), תאים המדכאים המופקת מיאלואידית (MDSCs), תאים דנדריטים (DC) ונויטרופילים (PMNs), תאי מיאלואידית מגויסים ממח עצם ובהדרגה לחדור גידולים, משחררים ציטוקינים, גורמי גדילה ופרוטאזות ה יכול לקדםצמיחה וגידול התפשטה 4. Crosstalk בין תאים סרטניים ותאי מיאלואידית הוא מורכב, אך דינמי. כך ההבנה של מהות יחסי הגומלין שלהם היא קריטית לקביעה מדוע תאים אלה לקדם התקדמות הסרטן במקום משתתף בתגובה חיסונית כנגד גידול, ועשויה לעזור למצוא מטרות חדשות כדי לשלוט בו.
תצפית ישירה על ידי מיקרוסקופ intravital מספקת מידע על דינמיקת תאים בתוך הרקמות של עכברים חיים 5. ארבעת צבעים, רב אזור, מערכת confocal דיסק מסתובב עם עדשות מיקרו נועד ללמוד תאי סטרומה בתוך גידולי החלב 6. גישה זו מאפשרת הדמיה רציפה לטווח ארוך וכוללת מספר יתרונות כגון (א) רכישת תמונות מהירות כדי למזער ממצא תנועה, (ב) הרדמה לטווח ארוך, ארבע רכישת צבע למעקב תאים מסוגים שונים (ג), תיוג ניאון (ד) רכיבים שונים של tumoral, ותצפית (ה) של שנינות microenvironments גידול שונהHin אותו העכבר כדי להימנע מעכבר ל7-9 השתנות עכבר. בעזרת טכנולוגיה זו, התנהגויות תאים שונות כבר דיווחו בוירוס גידול החלב מודל (MMTV) אונקוגן T אמצע polyoma מונע אמרגן (PyMT) המציג שלבים מתקדמים של יצירת גידולים. לימפוציטים מסוג T רגולטורים (Tregs, דמיין ידי transgene FOXP3 EGFP) להעביר באופן מועדף בסמוך לכלי דם ואילו DCS (CD11c-DTR-EGFP), פיברובלסטים הקשורים קרצינומה (Fsp1 + / + -EGFP) ותאי מיאלואידית (c-FMS -EGFP) מפגין תנועתיות גבוהה יותר בפריפריה מאשר הגידול במסת הגידול. במצב של היפוקסיה המערכתית החריפה, תאים נדדו באופן שונה: Tregs להפסיק נודדים בניגוד לתאי מיאלואידית שימשיכו לנוע 6. בנוסף, באותו מודל העכבר, זה כבר הראה כי רגישות דוקסורוביצין שינויים בשלב גידול, הפצת סמים קשורה לתגובת סמים, ודוקסורוביציןטיפול מביא לגיוס CCR2 תלוי של תאי מיאלואידית לגידולים. לפיכך, הדמיה חיה יכולה לשמש גם כדי לקבל תובנות לתוך תגובות בסמים באתר והביולוגיה של chemoresistance 10,11.
מוטציות גנטיות coli polyposis (APC) adenomatous בדרך הכלל מתרחשות באדנומות אנושיות מעי גס וקרצינומה 12 ומוטציה של עותק בודד של תוצאות גן APC בpolyposis המשפחתי adenomatous (FAP), אשר מקנה סיכון גבוה ביותר לסרטן מעי גס 13. זן העכבר Apc מינימום / + נושא מוטציה עיצור בקודון 850 של הגן APC ואופן ספונטני מתפתח אדנומות במעי מרובה בכל רחבי המעי הדק 14- 16. ההדמיה intravital לטווח ארוך של המעי היא מאתגרת בגלל הפולשנות של ההליך, שכן פתיחת חלל הצפק היא הכרחית לגישה למעי. הדמיה חיה לזמן קצר studies כבר פורסם בעבר במעי בריא 17,18, אבל תצפית ישירה לטווח הארוך של גידולים במעי לא דווחה. הליך כירורגי תוכנן ומעודן לדמיין גידולים דרך פני השטח serosal של המעי, תוך שימוש במערכת מיקרוסקופ דיסק ספינינג intravital ששימשה בעבר לגידולי שד תמונת 6,10. במאמר זה, פרוטוקול מתואר המאפשר אחד כדי לעקוב אחר התנהגותם של תאי מיאלואידית בתוך הגידולים במעי הדק באמצעות Apc מינימום / + עכברים.
Protocol
Representative Results
Discussion
במאמר זה, פרוטוקול מפורט מתואר לספינינג confocal הדמיה דיסק של דינמיקת תא מיאלואידית בגידולים במעי במשך כמה שעות בחי, צילמו מהצד serosal של המעיים.
כדי להימנע מדלקת ויש להם תנאים פיסיולוגיים אופטימליים, הדמיה של המעי צריכה להיעשות על הא?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות ליינג יו לגנוטיפ / + עכברי Min APC. מחקר זה נתמך על ידי כספים מINSERM ומענקים (CA057621 וAI053194) מהמכון הלאומי לבריאות.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| ApcMin/+ mice | Jackson Laboratory | 2020 | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 3773 | |
| cfms-EGFP mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| 2,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated | Invitrogen | D7139 | |
| Isoflurane | Butler Animal Health Supply | 29450 | |
| Nitrogen | UCSF | ||
| Oxygen | UCSF | ||
| 1X PBS | UCSF cell culture facility | ||
| Saline Buffer | UCSF cell culture facility | ||
| Anti-mouse Ly-6G (GR1) antibody AF647 | UCSF Monoclonal antibody core | Stock 1mg/ml. Use at 7ug/mouse | |
| Atropine | LARC UCSF | Use at 1mg/Kg mouse | |
| Alcohol wipes | Becton Dickinson | 326895 | |
| 28G1/2 insulin syringe | Becton Dickinson | 329465 | |
| Remium cover glass | Fisher Scientific | 12-548-5M | 24×50-1 |
| Superfrost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | 25x75x1mm |
| Krazy glue | Office Max | 7111555 | |
| Betadine | LARC UCSF | ||
| Heat blanket | Gaymar Industries | ||
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn ON 30min before use |
| Cotton tipped apllicators 6-inch | Electron Microscopy Sciences | 72310-10 | |
| Anesthesia system | Summit Anesthesia Support | ||
| Inverted microscope | Carl Zeiss Inc | Zeiss Axiovert 200M | |
| stage insert | Applied Sientific Instrumentation | ||
| Mouse Ox oximeter, software and sensors | Starr Life Sciences | MouseOx | |
| Nebulizer | Summit Anesthesia Support | ||
| Imaris | Bitplane | ||
| mManager | Vale lab, UCSF | Open-source software | |
| ICCD camera | Stanford Photonics | XR-Mega-10EX S-30 | |
| Spinning disk confocal sacan-head | Yokogawa Corporation | CSU-10b |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Schouppe, E., De Baetselier, P., Van Ginderachter, J. A., Sarukhan, A. Instruction of myeloid cells by the tumor microenvironment: Open questions on the dynamics and plasticity of different tumor-associated myeloid cell populations. Oncoimmunology. 1 (7), 1135-1145 (2012).
- Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism. Dev Cell. 18 (6), 884-901 (2010).
- Lohela, M., Werb, Z. Intravital imaging of stromal cell dynamics in tumors. Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 72-78 (2010).
- Egeblad, M., et al. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1 (2-3), 155-167 (2008).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Dynamic long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), (2011).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), (2011).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), (2011).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (73), e50088 (2013).
- Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
- Walther, A., et al. Genetic prognostic and predictive markers in colorectal cancer. Nat Rev Cancer. 9 (7), 489-499 (2009).
- Fearon, E. R. Molecular genetics of colorectal cancer. Annu Rev Pathol. 6, 479-507 (2011).
- Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse. Science. 247 (4940), 322-324 (1990).
- Su, L. K., et al. Multiple intestinal neoplasia caused by a mutation in the murine homolog of the APC gene. Science. 256 (5057), 668-670 (1992).
- Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
- McDole, J. R., et al. Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine. Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).
- Xu, C., Shen, Y., Littman, D. R., Dustin, M. L., Velazquez, P. Visualization of mucosal homeostasis via single- and multiphoton intravital fluorescence microscopy. J Leukoc Biol. 92 (3), 413-419 (2012).
- Haigis, K. M., et al. Differential effects of oncogenic K-Ras and N-Ras on proliferation, differentiation and tumor progression in the colon. Nat Genet. 40 (5), 600-608 (2008).
- Sansom, O. J., et al. Loss of Apc allows phenotypic manifestation of the transforming properties of an endogenous K-ras oncogene in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (38), 14122-14127 (2006).
- Janssen, K. P., et al. APC and oncogenic KRAS are synergistic in enhancing Wnt signaling in intestinal tumor formation and progression. Gastroenterology. 131 (4), 1096-1109 (2006).
- Takaku, K., et al. Intestinal tumorigenesis in compound mutant mice of both Dpc4 (Smad4) and Apc genes. Cell. 92 (5), 645-656 (1998).
