Summary

In tempo reale Imaging di cellule mieloidi Dynamics in<em> Apc<sup> Min / +</sup</em> Intestinale tumori da Spinning Disk Microscopia confocale

Published: October 06, 2014
doi:

Summary

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

Abstract

Cellule mieloidi sono i più abbondanti cellule immunitarie all'interno di tumori e hanno dimostrato di promuovere la progressione tumorale. Le moderne tecniche di imaging intravitale permettono l'osservazione del comportamento cellulare dal vivo all'interno dell'organo, ma può essere difficile in alcuni tipi di cancro a causa di organo e tumore accessibilità, come l'intestino. L'osservazione diretta dei tumori intestinali non è stato segnalato in precedenza. Una procedura chirurgica qui descritta permette l'osservazione diretta delle dinamiche di cellule mieloidi all'interno dei tumori intestinali nei topi dal vivo utilizzando topi transgenici reporter fluorescente e traccianti iniettabili o anticorpi. A questo scopo, è stato utilizzato un quattro-colore, multi-regione, disco rotante microscopio confocale micro-lensed che consente a lungo termine di imaging continuo con l'acquisizione rapida di immagini. Apc Min / + topi che sviluppano più adenomi nel piccolo intestino è attraversato con i topi c-fms-EGFP per visualizzare le cellule mieloidi e con i topi ACTB-ECFPper visualizzare le cellule epiteliali intestinali delle cripte. Sono inoltre descritte le procedure per etichettare diversi componenti tumorali, come i vasi sanguigni e neutrofili, e la procedura per il posizionamento del tumore per l'imaging attraverso la superficie sierosa. Filmati time-lapse compilati da diverse ore dell'imaging consentono l'analisi del comportamento delle cellule mieloidi in situ nel microambiente intestinale.

Introduction

Prove schiaccianti ora dimostra che il microambiente tumorale, costituito da popolazioni cellulari eterogenee, inclusi i fibroblasti, cellule endoteliali, cellule immunitarie e infiammatorie, matrice extracellulare e fattori solubili, svolge un ruolo cruciale nella iniziazione e progressione dei tumori solidi contribuendo a quasi tutti caratteristiche di cancro 1. Infatti, durante la progressione del tumore, ci sono costanti interazioni dinamiche tra cellule tumorali trasformate e le cellule stromali che si evolvono per generare un microambiente favorevole alla malignità 2. Tra le cellule immunitarie che infiltrano il microambiente tumorale, le cellule mieloidi sono i più abbondanti 3. Composto da macrofagi associati al tumore (TAM), derivati ​​da cellule mieloidi soppressore (MDSCs), cellule dendritiche (DC) e neutrofili (PMN), le cellule mieloidi sono reclutati dal midollo osseo e progressivamente si infiltrano i tumori, rilasciando citochine, fattori di crescita e proteasi che può promuoverela crescita del tumore e la diffusione 4. Il crosstalk tra le cellule tumorali e le cellule mieloidi è complessa ma dinamica. Così la comprensione della natura delle loro interazioni è fondamentale per determinare il motivo per cui queste cellule favoriscono la progressione del cancro, invece di partecipare a una risposta immunitaria anti-tumorale, e può aiutare a trovare nuovi obiettivi per controllarlo.

L'osservazione diretta al microscopio intravitale fornisce informazioni sulle dinamiche delle cellule all'interno dei tessuti di topi vivi 5. A quattro colori, multi-regione, disco rotante micro-lensed sistema confocale è stato progettato per studiare le cellule stromali all'interno di tumori mammari 6. Questo approccio consente di imaging continuo a lungo termine e comprende diversi vantaggi, come (a) acquisizione immagini rapide per ridurre al minimo gli artefatti da movimento, (b) l'anestesia-lungo termine, (c) l'acquisizione di quattro colori di seguire diversi tipi di cellule, (d) l'etichettatura fluorescente delle diverse componenti tumorali, e (e) l'osservazione di diversi microambienti tumorali within lo stesso mouse per evitare il mouse per variabilità del mouse 7-9. Con questa tecnologia, i comportamenti cellulari diversi sono stati riportati nel virus del tumore mammario (MMTV) promotore-driven polioma middle T oncogene (PyMT) modello che mostra le fasi progressive della tumorigenesi. Regolamentazione linfociti T (Tregs, visualizzati dal transgene Foxp3 EGFP) migrare preferenzialmente in prossimità di vasi sanguigni che il DCS (CD11c-DTR-EGFP), fibroblasti carcinoma-associata (Fsp1 + / + -EGFP) e cellule mieloidi (c-fms -EGFP) presentano elevata motilità alla periferia del tumore rispetto all'interno della massa tumorale. Nella condizione di ipossia sistemica acuta, le cellule migrate in modo diverso: Tregs fermare la migrazione al contrario di cellule mieloidi che continuano a muoversi 6. Inoltre, nello stesso modello di topo, è stato dimostrato che le variazioni di sensibilità doxorubicina con stadio tumorale, distribuzione del farmaco è legato alla risposta ai farmaci, e doxorubicinatrattamento porta al reclutamento CCR2-dipendente delle cellule mieloidi ai tumori. Così, l'imaging dal vivo può essere utilizzato anche per acquisire conoscenze in risposta ai farmaci in situ e la biologia di chemioresistenza 10,11.

Poliposi adenomatosi coli (APC) mutazioni del gene comunemente si verificano in adenomi colorettali umani e carcinomi 12 e mutazione di una singola copia dei risultati gene APC nella poliposi adenomatosa familiare (FAP), che conferisce un altissimo rischio di cancro al colon 13. Il ceppo di topi Apc Min / + porta una mutazione troncamento al codone 850 del gene Apc e si sviluppa spontaneamente più adenomi intestinali tutto il piccolo intestino da 14 a 16. A lungo termine intravitale imaging dell'intestino è impegnativo a causa della invasività della procedura, poiché l'apertura della cavità peritoneale è necessaria per l'accesso a livello intestinale. A breve termine l'imaging dal vivo studies sono stati precedentemente pubblicati sulla salute dell'intestino 17,18, ma l'osservazione diretta a lungo termine dei tumori intestinali non è stato riportato. Una procedura chirurgica è stato progettato e perfezionato per visualizzare i tumori attraverso la superficie sierosa dell'intestino, utilizzando il sistema di microscopia a disco rotante intravitale precedentemente utilizzato per i tumori della mammella immagine 6,10. In questo lavoro, un protocollo è descritto che permette di seguire il comportamento delle cellule mieloidi all'interno dei tumori del piccolo intestino utilizzando Apc Min / + topi.

Protocol

NOTA: Tutti gli esperimenti su animali sono stati condotti in conformità con le procedure approvate dalla cura e uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC), UCSF. Tutti gli esperimenti di imaging sono procedure non-sopravvivenza e gli animali sono stati sacrificati immediatamente successivo alla fine della acquisizione delle immagini. 1 Generazione di topi NOTA: Apc Min / + topi, che trasportano una mutazione sul gene Apc, svilup…

Representative Results

Utilizzando filatura disco microscopia confocale, tessuti non tumorali e tumorali nel piccolo intestino di Apc Min / +; ACTB-ECFP; topi c-fms-ECFP possono essere visualizzati dalla superficie sierosa. Dopo l'imaging, software della fotocamera viene utilizzato per analizzare e regolare l'acquisizione (Figura supplementare 1). Dopo endovenosa (iv) l'inserimento di fluorescenza 2.000 kDa destrano-rodamina e un anticorpo coniugato Ly-6G 647, vasi sanguigni e…

Discussion

In questo lavoro, un protocollo dettagliato è descritto per la filatura del disco confocale delle dinamiche di cellule mieloidi in tumori intestinali per diverse ore in un animale vivo, ripresa dal lato sierosa dell'intestino.

Per evitare l'infiammazione e di avere condizioni fisiologiche ottimali, imaging dell'intestino deve essere fatto sull'organo intatta. Tuttavia, l'imaging dal lato sierosa dell'intestino è impegnativo, poiché la luce deve passare attraverso d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vorremmo ringraziare Ying Yu per Apc Min / + topi genotipizzazione. Questo studio è stato sostenuto da fondi provenienti da INSERM e sovvenzioni (CA057621 e AI053194) dal National Institutes of Health.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
ApcMin/+ mice Jackson Laboratory 2020
ACTB-ECFP mice Jackson Laboratory 3773
cfms-EGFP mice Jackson Laboratory 18549
2,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated Invitrogen D7139
Isoflurane Butler Animal Health Supply 29450
Nitrogen UCSF
Oxygen UCSF
1X PBS UCSF cell culture facility
Saline Buffer UCSF cell culture facility
Anti-mouse Ly-6G (GR1) antibody AF647 UCSF Monoclonal antibody core Stock 1mg/ml. Use at 7ug/mouse
Atropine LARC UCSF Use at 1mg/Kg mouse
Alcohol wipes Becton Dickinson 326895
28G1/2 insulin syringe Becton Dickinson 329465
Remium cover glass Fisher Scientific 12-548-5M 24×50-1
Superfrost plus microscope slides Fisher Scientific 12-550-15 25x75x1mm
Krazy glue Office Max 7111555
Betadine LARC UCSF
Heat blanket Gaymar Industries
Hot bead sterilizer Fine Science Tools 18000-45 Turn ON 30min before use
Cotton tipped apllicators 6-inch Electron Microscopy Sciences 72310-10
Anesthesia system Summit Anesthesia Support
Inverted microscope Carl Zeiss Inc Zeiss Axiovert 200M
stage insert Applied Sientific Instrumentation
Mouse Ox oximeter, software and sensors Starr Life Sciences MouseOx
Nebulizer Summit Anesthesia Support
Imaris Bitplane
mManager Vale lab, UCSF Open-source software
ICCD camera Stanford Photonics XR-Mega-10EX S-30
Spinning disk confocal sacan-head Yokogawa Corporation CSU-10b

References

  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  2. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
  3. Schouppe, E., De Baetselier, P., Van Ginderachter, J. A., Sarukhan, A. Instruction of myeloid cells by the tumor microenvironment: Open questions on the dynamics and plasticity of different tumor-associated myeloid cell populations. Oncoimmunology. 1 (7), 1135-1145 (2012).
  4. Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism. Dev Cell. 18 (6), 884-901 (2010).
  5. Lohela, M., Werb, Z. Intravital imaging of stromal cell dynamics in tumors. Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 72-78 (2010).
  6. Egeblad, M., et al. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1 (2-3), 155-167 (2008).
  7. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Dynamic long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), (2011).
  8. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), (2011).
  9. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), (2011).
  10. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (73), e50088 (2013).
  11. Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
  12. Walther, A., et al. Genetic prognostic and predictive markers in colorectal cancer. Nat Rev Cancer. 9 (7), 489-499 (2009).
  13. Fearon, E. R. Molecular genetics of colorectal cancer. Annu Rev Pathol. 6, 479-507 (2011).
  14. Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse. Science. 247 (4940), 322-324 (1990).
  15. Su, L. K., et al. Multiple intestinal neoplasia caused by a mutation in the murine homolog of the APC gene. Science. 256 (5057), 668-670 (1992).
  16. Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
  17. McDole, J. R., et al. Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine. Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).
  18. Xu, C., Shen, Y., Littman, D. R., Dustin, M. L., Velazquez, P. Visualization of mucosal homeostasis via single- and multiphoton intravital fluorescence microscopy. J Leukoc Biol. 92 (3), 413-419 (2012).
  19. Haigis, K. M., et al. Differential effects of oncogenic K-Ras and N-Ras on proliferation, differentiation and tumor progression in the colon. Nat Genet. 40 (5), 600-608 (2008).
  20. Sansom, O. J., et al. Loss of Apc allows phenotypic manifestation of the transforming properties of an endogenous K-ras oncogene in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (38), 14122-14127 (2006).
  21. Janssen, K. P., et al. APC and oncogenic KRAS are synergistic in enhancing Wnt signaling in intestinal tumor formation and progression. Gastroenterology. 131 (4), 1096-1109 (2006).
  22. Takaku, K., et al. Intestinal tumorigenesis in compound mutant mice of both Dpc4 (Smad4) and Apc genes. Cell. 92 (5), 645-656 (1998).

Play Video

Cite This Article
Bonnans, C., Lohela, M., Werb, Z. Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (92), e51916, doi:10.3791/51916 (2014).

View Video