Imágenes en tiempo real de las células mieloides en Dinámica<em> Apc<sup> Min / +</sup</em> Intestinal Tumores de Spinning disco microscopía confocal
Summary
By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.
Abstract
Células mieloides son las células inmunes más abundantes dentro de los tumores y se ha demostrado para promover la progresión tumoral. Técnicas de imagen intravital modernos permiten la observación del comportamiento celular en vivo en el interior del órgano, pero puede ser un reto en algunos tipos de cáncer debido a la accesibilidad de órganos y el tumor tales como intestino. La observación directa de los tumores intestinales no ha sido descrito previamente. Un procedimiento quirúrgico aquí descrito permite la observación directa de la dinámica celular mieloides dentro de los tumores intestinales en ratones vivos mediante el uso de ratones transgénicos reportero fluorescente y trazadores inyectables o anticuerpos. Para este propósito, una de cuatro colores, multi-región, disco giratorio microscopio confocal micro-lensed que permite formación de imágenes continua a largo plazo con una rápida adquisición de la imagen se ha utilizado. APC Min / + ratones que desarrollan múltiples adenomas en el intestino delgado se cruzan con los ratones c-FMS-EGFP para visualizar las células mieloides y con ratones ACTB-ECFPpara visualizar las células epiteliales intestinales de las criptas. También se describen procedimientos para el etiquetado de diferentes componentes tumorales, tales como vasos sanguíneos y neutrófilos, y el procedimiento para el posicionamiento del tumor para formación de imágenes a través de la superficie serosa. Time-lapse películas recopilados de varias horas de proyección de imagen permiten el análisis del comportamiento de las células mieloides in situ en el microambiente intestinal.
Introduction
Evidencia abrumadora ahora demuestra que el microambiente tumoral, que consiste en poblaciones de células heterogéneas, incluyendo fibroblastos, células endoteliales, células inmunes e inflamatorias, matriz extracelular, y factores solubles, juega un papel crucial en la iniciación y progresión de tumores sólidos mediante la contribución a casi todos características del cáncer 1. De hecho, durante la progresión tumoral, hay constantes interacciones dinámicas entre las células cancerosas transformadas y las células del estroma que evolucionan para generar un microambiente favorable a la malignidad 2. Entre las células inmunes que infiltran el microambiente tumoral, las células mieloides son los más abundantes 3. Compuesto de macrófagos asociados al tumor (TAM), células supresoras de origen mieloide (MDSCs), células dendríticas (DC) y los neutrófilos (PMNs), células mieloides son reclutados desde la médula ósea y se infiltran en los tumores progresivamente, liberando citoquinas, factores de crecimiento y proteasas que puede promoverel crecimiento del tumor y se extendió 4. La diafonía entre las células cancerosas y las células mieloides es compleja, pero dinámico. Por lo tanto la comprensión de la naturaleza de sus interacciones es crucial para determinar por qué estas células promueven la progresión del cáncer en lugar de participar en una respuesta inmune anti-tumor, y puede ayudar a encontrar nuevas dianas para controlarla.
La observación directa por microscopía intravital proporciona información sobre la dinámica de células dentro de los tejidos de ratones vivos 5. Un niño de cuatro-color, multi-región, el sistema confocal de disco giratorio micro-lensed fue diseñado para estudiar las células del estroma en los tumores mamarios 6. Este enfoque permite formación de imágenes continuo a largo plazo e incluye varias ventajas, tales como (a) adquisición de imágenes rápidas para minimizar los artefactos de movimiento, (b) la anestesia a largo plazo, (c) adquisición de cuatro colores para seguir diferentes tipos de células, (d) el marcaje fluorescente de diferentes componentes tumorales, y (e) observación de diferentes microambientes tumorales ingeniohin el mismo ratón evitar ratón para 7-9 variabilidad ratón. Con esta tecnología, diferentes comportamientos celulares han sido reportados en el modelo de virus de tumor mamario (MMTV) polioma medio promotor impulsado T oncogén (PYMT) que muestra etapas progresivas de la tumorigénesis. Linfocitos T reguladores (Treg, visualizado por el transgén EGFP Foxp3) migran preferentemente en la proximidad de los vasos sanguíneos que el DCS (CD11c-DTR-EGFP), fibroblastos de carcinoma asociado (FSP1 + / + EGFP) y las células mieloides (c-fms EGFP) exhiben mayor motilidad en la periferia del tumor que dentro de la masa tumoral. En la condición de hipoxia sistémica aguda, las células migraron de manera diferente: Tregs detener la migración en contraste con las células mieloides que continúan mover 6. Además, en el mismo modelo de ratón, se ha demostrado que los cambios de sensibilidad doxorrubicina con el estadio del tumor, la distribución de drogas está relacionada con la respuesta al fármaco, y doxorrubicinatratamiento conduce a la contratación CCR2-dependiente de las células mieloides a los tumores. Por lo tanto, las imágenes en directo también se puede utilizar para obtener información sobre las respuestas de drogas in situ y la biología de la quimio-resistencia 10,11.
Poliposis coli (APC) mutaciones genéticas adenomatosos ocurren comúnmente en los adenomas colorrectales y carcinomas humanos 12 y la mutación de una sola copia de los resultados Apc genes en la poliposis adenomatosa familiar (PAF), que confiere un riesgo extremadamente alto de cáncer de colon 13. La cepa de ratón APC Min / + lleva una mutación en el codón 850 truncamiento del gen APC y se desarrolla de forma espontánea múltiples adenomas intestinales en todo el intestino delgado de 14 16. Intravital de imágenes a largo plazo del intestino es difícil debido a la invasividad del procedimiento, desde la apertura de la cavidad peritoneal es necesaria para el acceso al intestino. Corto plazo de imágenes en vivo studies han sido publicados anteriormente en intestino sano 17,18, pero la observación directa a largo plazo de los tumores intestinales no se ha reportado. Un procedimiento quirúrgico ha sido diseñado y perfeccionado para visualizar tumores a través de la superficie serosa del intestino, usando el sistema de microscopía intravital disco giratorio utilizado anteriormente para los tumores de mama 6,10 imagen. En este trabajo, un protocolo se describe que permite seguir el comportamiento de las células mieloides dentro de los tumores en el intestino delgado mediante el uso de APC Min / + ratones.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este trabajo, un protocolo detallado se describe para la hilatura disco de imagen confocal de las dinámicas celulares mieloides en tumores intestinales durante varias horas en un animal vivo, fotografiados desde la parte serosa del intestino.
Para evitar la inflamación y para tener condiciones fisiológicas óptimas, formación de imágenes del intestino tiene que ser hecho en el órgano intacto. Sin embargo, las imágenes desde el lado de la serosa del intestino es un reto, ya que la l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias a Ying Yu para APC Min / + ratones genotipado. Este estudio fue apoyado por fondos del INSERM y donaciones (CA057621 y AI053194) de los Institutos Nacionales de Salud.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| ApcMin/+ mice | Jackson Laboratory | 2020 | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 3773 | |
| cfms-EGFP mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| 2,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated | Invitrogen | D7139 | |
| Isoflurane | Butler Animal Health Supply | 29450 | |
| Nitrogen | UCSF | ||
| Oxygen | UCSF | ||
| 1X PBS | UCSF cell culture facility | ||
| Saline Buffer | UCSF cell culture facility | ||
| Anti-mouse Ly-6G (GR1) antibody AF647 | UCSF Monoclonal antibody core | Stock 1mg/ml. Use at 7ug/mouse | |
| Atropine | LARC UCSF | Use at 1mg/Kg mouse | |
| Alcohol wipes | Becton Dickinson | 326895 | |
| 28G1/2 insulin syringe | Becton Dickinson | 329465 | |
| Remium cover glass | Fisher Scientific | 12-548-5M | 24×50-1 |
| Superfrost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | 25x75x1mm |
| Krazy glue | Office Max | 7111555 | |
| Betadine | LARC UCSF | ||
| Heat blanket | Gaymar Industries | ||
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn ON 30min before use |
| Cotton tipped apllicators 6-inch | Electron Microscopy Sciences | 72310-10 | |
| Anesthesia system | Summit Anesthesia Support | ||
| Inverted microscope | Carl Zeiss Inc | Zeiss Axiovert 200M | |
| stage insert | Applied Sientific Instrumentation | ||
| Mouse Ox oximeter, software and sensors | Starr Life Sciences | MouseOx | |
| Nebulizer | Summit Anesthesia Support | ||
| Imaris | Bitplane | ||
| mManager | Vale lab, UCSF | Open-source software | |
| ICCD camera | Stanford Photonics | XR-Mega-10EX S-30 | |
| Spinning disk confocal sacan-head | Yokogawa Corporation | CSU-10b |
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