Измерение пространственных и временных Ca^{2 +} Сигналы в Arabidopsis растений

Summary

Сигнализации ^Ca 2 + регулирует разнообразные биологические процессы в растениях. Здесь мы представляем подходы для мониторинга абиотическую стресс, вызванный пространственная и временная Са ^{2 +} сигналы в Arabidopsis клеток и тканей с использованием генетически закодированные Ca ^{2 +} показатели экворин или Case12.

Abstract

Развивающие и средовые сигналы вызывают Ca ^{2 +} колебания в клетках растений. Стимул конкретных пространственно-временные Са ^{2 +} модели воспринимаются сотовых Ca ^{2 +} связывающих белков, которые инициируют Ca ^{2 +} сигнальные каскады. Тем не менее, мы все еще ​​мало знаем о том, как стимул сигналы конкретного ^Ca 2 + генерируются. Специфика сигнала Са ^{2 +} может быть связано с сложной регуляции деятельности каналов Са ^{2 +} и / или перевозчиков в ответ на данный стимул. Чтобы определить эти клеточные компоненты и понять свои функции, она имеет решающее значение для использования системы, позволяющие чувствительный и надежный запись сигналов ^Ca 2 + как на тканевом и клеточном уровнях. Генетически кодируемые Са ^{2 +} показатели, которые ориентированы на различные клеточные отсеков обеспечили платформу для живых клеток конфокальной микроскопии клеточных Са ^{2 +} сигналов. Здесь мы опишем инструкциюс для использования двух Са ^{2 +} систем обнаружения: экворин основе ФАС (фильм клейкие саженцы) люминесценции Ca ^{2 +} изображений и case12 основе конфокальной флуоресцентной живая клетка Ca ^{2 +} изображения. Свечение изображений с помощью системы FAS обеспечивает простой, надежный и чувствительный обнаружение пространственных и временных Са ^{2 +} сигналов на тканевом уровне, в то время как конфокальной микроскопии живых клеток с помощью Case12 обеспечивает одновременное обнаружение цитозольного и ядерных Са ^{2 +} сигналов с высоким разрешением.

Introduction

Растительная клетка реагирует на окружающую среду посредством сигнализации, которая координирует сотовые действия. Рано клеток событие сигнализации в ответ на раздражители среды является переходным Ca ^{2 +} увеличение. Узор, или подпись преходящим повышением в свободном Са ^{2 +} концентрации характеризуется своей амплитудой, частотой и длительностью. Различные пространственно-временные подписи ^Ca 2 + регулировать различные клеточные активности ^1. Конкретные стимулы, такие как тепло, холод, соль, засухи, света, или растительных гормонов, может точно настроить пространственно-временную активность мембранных локализованные Са ^{2 +} каналов и / или перевозчиков, в результате конкретных Са ^{2 +} подписей. Хотя Са ^{2 +} транспортеры были хорошо характеризуется, мало известно о молекулярных идентичностей и функций каналов ^Ca 2 + в растения ^1. Генетические экраны для мутантов с измененной Са ^{2 +} ответ на стресс стимулы могут быть эффективным октренере для идентификации компонентов, которые составляют подписей ^Ca 2 ^+. Недавно на основе нескольких экворин Са ^{2 +} системы обнаружения были разработаны облегчить генетические экраны для Са ^{2 +} компоненты сигнализации в ответ атаки патогена и абиотическим стрессам ^2-4.

Экворин был впервые использован для обнаружения Са ^{2 +} сигналы в растениях в начале 1990-х годов ^5. С тех пор, экворин была ориентирована в различных клеточных компартментах, таких как цитоплазме ^{5, 6} ядра, хлоропластов ^{7, 8,} тонопласт митохондрий ^{9, 10} и стромы, а также в различных типах клеток в корне, чтобы контролировать конкретную клетку Са ^{2 +} сигналы ^11. Измерений, основанный экворин ^Ca 2 + выявить пространственную и временную Ca ^{2 +} ответ популяции клеток под напряжением стимулы. Тем не менее, в большинстве случаев, Са ² + ответы одиночных клеток являются unsynchroniзет в ответивших ткани ^4. Поэтому записи экворин ^Ca 2 + не обязательно сообщить Са ^{2 +} сигнал в индивидуальных клетках. В последние годы, генетически кодируемых флуоресцентный белок (ФП) основе Ca ^{2 +} показатели, такие как желтый Cameleon (YCS) ¹² и ¹³ CASEs12 были использованы для изучения Са ^{2 +} сигналов с высоким разрешением субклеточном. YCS являются флуоресценции резонансный перенос энергии (FRET) основе Ca ^{2 +} показатели, содержащий CFP и YFP варианты связаны с Са ^{2 +-связывающий} белок кальмодулин и калмодулин связывания пептида М13. Кальмодулин претерпевает конформационные изменения, как он связывается с Са ^{2 +,} тем самым приносит CFP и YFP ближе друг к другу, что приводит к увеличению передачи энергии (усиливается лад). Уровень FRET в течение долгого времени, рассчитанный примерно как отношение YFP к интенсивности сигналов CFP, отражает внутриклеточного Ca2 ⁺ динамику. Несколько YC варианты были использованы в растениях. YC3.6 было тargeted в цитозоль ^14,15, ядра ^16, митохондрий ¹⁷ и мембране ^18, и YC4.6 и D4ER были направлены в отделение скорой ^15,19, и D3cpv была направлена ​​на пероксисомах ^20. Трансгенные растения, выражающие YCS позволить жить-ячейки изображения Ca ^{2 +} динамики внутри различных клеточных отсеках различных типов клеток. Случаях (предположительно Ca lcium себе nsor) одиночные циркулярно переставляются флуоресцентные белки (cpFPs), несущие калмодулин и калмодулина-связывающий пептид М13. После связывания с Са ^{2 +,} МИОНы пройти конформационные изменения, что приводит к увеличению интенсивности флуоресценции. Корреляция между ответ флуоресценции МИОНа и Са ^{2 +} концентрации позволяет внутриклеточный Ca ^{2 +} динамика должна быть измерена количественно. Case12 вариант увеличилась флуоресценции 12 раз в Са ^{2 +} -насыщенных форм. Н. benthiminana растения временно EXPRэссинга Case12 или Arabidopsis растения, стабильно экспрессирующие Case 12 были использованы для изучения Ca ^{2 +} сигнализацию в оборонной и абиотическим стрессам ^4,21. Асинхронный пространственная и временная Ca ^{2 +} колебания в клетках, отвечающих на атаки патогена, или к обезвоживанию стресса были выявлены с основанной Case12 Са ^{2 +} визуализации.

Здесь мы представляем подробные инструкции по экворин основе люминесценции визуализации ткани, так и стимулов определенной Са ^{2 +} динамика в Arabidopsis рассаду, и для конфокальной микроскопии от цитозольной и ядерной Са ^{2 +} динамика в Arabidopsis корневых клеток, которые выражают Дело 12. люминесценции изображений ФАС может быть адаптирована для анализа стресс-индуцированной Ca ^{2 +} динамику в целые растения или тканей, не описанных здесь, или для скрининга мутагенизированных популяции растений Arabidopsis для мутантов с измененной стресса, вызванного Са ^{2 +} сигналов. Установка изображений живых клеток ^Ca 2 + могут быть адаптированы для анализа Ca2 + динамика в рамках различных отсеков subcelluar или в различных типах клеток с помощью других Ca ^{2 +} показатели.

Protocol

1 экворин основе Ca 2 + изображений Использование системы FAS Подготовка саженцев для визуализации люминесценции. Стерилизацию семена Arabidopsis растений, экспрессирующих экворин 10% раствором хлорной извести, содержащей 0,01% Triton-100. Сейте стерильные семена на квадратной пластины (10 …

Representative Results

Маннитол, NaCl и H 2 O 2 были использованы в качестве прокси для обезвоживания, соли и окислительного стресса стимулов, соответственно. Чтобы убедиться, что тяжелых ионов металла Cu 2 + синергетический эффект с любой из этих трех стрессовых раздражителей, мы сравнили Ca 2 +</s…

Discussion

Мы продемонстрировали систему FAS для записи пространственно-временную Ca ^{2 +} ответ Arabidopsis рассады. Это ФАС Ca ^{2 +} система записи обеспечивает простой, чувствительный и надежный подход, который может быть адаптирован для измерения Са ^{2 +} динамику запускаются различными стим…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
10X10 cm square petri dish	VWR	60872-310
adhesive film	VWR	60941-062
polyethylene tubing	PerkinElmer	9908265
1 mL syringe	VWR	53548-000
silicone grease	Beckman	335148
2-well chambered cover glass	Nalge Nunc international	155379
8-well chambered cover glass	Nalge Nunc international	155409
luminescence imaging system	Princeton Instruments	N/A
inverted confocal laser-scanning microscope	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon A1R
Imaging software	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon Elements
ImageJ	NIH	N/A	Public domain, Java-based image processing program
DataGraph	Visual Data Tools Inc	N/A	DataGraph 3.1.1 is the newest version
coelenterazine	NanoLight Technolgies	#301B NF-BCTZ-FB
All purpose Bleach	Any local store	N/A
Triton X-100	Fisher	BP151500
MS salt	Phytotechnology Labs	M524-50L
sucrose	VWR	BDH8029-12KG
Agar	Sigma	A1296-5KG
Phytagel	Sigma	P8169-1KG