Inyección ortotópico de células de cáncer de mama en el Mamaria Fat Pad de ratones para estudiar el crecimiento del tumor.

Summary

El cáncer es una enfermedad compleja que se ve influenciada por el tejido que rodea al tumor, así como pro- local y anti-inflamatorias mediadores. Por lo tanto, los modelos de inyección de ortotrópicos, en lugar de los modelos subcutáneos pueden ser útiles para estudiar la progresión del cáncer de una manera que imita mejor la patología humana.

Abstract

El crecimiento del cáncer de mama puede ser estudiado en ratones utilizando una gran cantidad de modelos. La manipulación genética de las células de cáncer de mama puede ayudar a comprender las funciones de las proteínas implicadas en la progresión oncogénica o ayuda a descubrir nuevos supresores tumorales. Además, la inyección de células de cáncer en ratones con diferentes genotipos podría proporcionar una mejor comprensión de la importancia del compartimiento del estroma. Muchos modelos pueden ser útiles para investigar ciertos aspectos de la progresión de la enfermedad, pero no recapitular todo el proceso canceroso. En contraste, las células de cáncer de mama injerto a la almohadilla de grasa mamaria de ratones mejores recapitula la localización de la enfermedad y la presencia del compartimiento del estroma apropiada y por lo tanto mejor imita enfermedad cancerosa humana. En este artículo, describimos cómo implantar las células del cáncer de mama en ratones ortotópicamente y explicar cómo recolectar tejidos para analizar la: 14px; line-height:. 28px; "> medio del tumor y la metástasis a órganos distantes uso de este modelo, muchos aspectos (crecimiento, la angiogénesis y la metástasis) de cáncer pueden ser investigados simplemente proporcionando un ambiente adecuado para las células tumorales crezcan.

Introduction

El cáncer es una enfermedad muy compleja que ha sido objeto de estudios por más siglos. El cáncer de mama es el tipo de cáncer más común; se produce predominantemente en las mujeres, pero puede también ocurrir esporádicamente en los hombres ^27. La enfermedad es causada principalmente por la pérdida de mecanismo de control de la división celular de gobierno que a su vez conduce a un crecimiento infinito de las células en el cuerpo. Estas disfunciones pueden ser causadas por varios mecanismos: primero, las células sanas necesitan señales de crecimiento de las células circundantes con el fin de proliferar mientras que las células de cáncer hacen sus propios factores de crecimiento y aumentan la expresión de los receptores del factor de crecimiento obteniendo así una tasa de proliferación superior ^1; segundo, las células cancerosas son menos susceptibles a las señales anti-proliferativos ^8; tercero, para equilibrar el número de células en también es necesaria la muerte de las células del cuerpo; Sin embargo, las células de cáncer de escape de la muerte celular programada, denominada apoptosis ^14; cuarto, las células se adhieren a matrices extracelularescon el fin de sobrevivir, pero las células tumorales pueden crecer sin la necesidad de unión y muestran resistencia a la anoikis ^19; quinto, la activación de la telomerasa evita el acortamiento de los telómeros y evita que la senescencia replicativa ^21; por último pero no menos importante, la omisión del control de calidad del ADN tras los resultados de la mitosis en el contenido genético alterado ^15,16. Con el fin de identificar los oncogenes o supresores tumorales que juegan un papel en esta proliferación desregulada, experimentos de crecimiento de tumor en ratones son cruciales.

El crecimiento primario del tumor generalmente no es la principal razón de la muerte. La migración de las células cancerosas desde el sitio primario a un sitio secundario, denominado metástasis, es la causa principal de muerte en la mayoría de los pacientes de cáncer ^22. Metástasis implica invasión de células tumorales, intravasación, viajando a través de la circulación, evitando inmune ataque, la extravasación y el crecimiento en el sitio secundario. Epitelial a mesenquimal (EMT) es un proceso clave enmetástasis e implica un cambio en los perfiles de expresión génica produciendo células con mayor movilidad y capacidad de invasión, que son requisitos previos para la célula de metástasis ^12. Como el proceso canceroso es la resultante de una combinación de diversas acciones, incluyendo las interacciones recíprocas entre las células cancerosas, las células del estroma y las células pro- y anti-inflamatorias, un enfoque in vitro de cáncer a menudo no proporciona completa información sobre el proceso canceroso. De manera similar, los tratamientos contra el cáncer que afectan a la vasculatura del tumor a menudo pueden no ser estudiados in vitro, por lo tanto el uso de enfoques in vivo es inevitable.

Para estudiar la progresión del cáncer de mama, se han desarrollado diferentes métodos experimentales. El modelo más ampliamente utilizado es la inyección subcutánea de células de cáncer de mama en ratones ^5. En esta configuración experimental, el investigador puede introducir una amplia gama de alteraciones a una línea celular de elección in vitro (es decir,upregulation, regulación a la baja de las proteínas) e inyectar las células debajo de la piel. Aunque este método es sencillo y el proceso de inyección es simple, sin necesidad de realizar la cirugía en los ratones, el sitio en el que se inyecta el tumor no representa el ambiente del tumor mamario local y la ausencia de este entorno puede resultar en el desarrollo del cáncer de mama que se difiere de la observada en patología humana. En segundo lugar, los ratones genéticamente modificados se utilizan frecuentemente como una herramienta in vivo para estudiar la progresión del cáncer de mama. En este modelo, el oncogén (es decir PYMT, Neu) la expresión es conducida por un promotor específico de tejido mamario que conduce a la formación espontánea de s tumor de mama. Esta configuración experimental es útil para estudiar el aspecto de tratamiento de la enfermedad mediante la inyección de drogas o anticuerpos mientras comprueba el tamaño del tumor en el tiempo ^3. Sin embargo, la cría de estos ratones con otras cepas de ratones deficientes o mutados en un gen de interés también podría dar insERECHOS en el papel de diferentes proteínas en el crecimiento del tumor de mama ^24. La desventaja de este modelo es que es propenso a la variación en el tamaño del tumor y el número. Por otra parte, el nivel de expresión del transgen depende del sitio de integración en el genoma y se puede cambiar de una cepa de ratón a otro ^4. En este modelo, la expresión del transgén se puede lograr por todas las células con origen epitelial mientras que en la enfermedad humana, sólo una subpoblación de células expresan el oncogén o regular a la baja los niveles supresores de tumores ^26. Para estudiar la metástasis, las células del cáncer de mama también se pueden inyectar por vía intravenosa (un modelo denomina metástasis experimental) ^25. Sin embargo, este enfoque sólo recapitula el proceso metastásico parcialmente; elude el requisito de las células tumorales para invadir y intravasate, y se inicia desde el punto en el que las células tumorales son fácilmente presente en la circulación.

En nuestro trabajo, utilizamos una inyección ortotópicoion modelo para estudiar la implicación de los genes de interés en la progresión del cáncer de mama ^13. Nos sobreexpresan la proteína en las células del cáncer de mama humano e inyectarlos en la almohadilla de grasa mamaria de ratones NOD / SCID gamma (NSG) ratones. Este método es ventajoso en muchos aspectos: permite cambios genéticos muy rápidos y diversos en la línea celular inyectada, que abarca todo el proceso de la progresión del cáncer de mama de crecimiento del tumor primario a la metástasis en los sitios patológicamente relevantes, y también proporciona un buen modelo experimental para estudiar el impacto de los tratamientos terapéuticos en etapas tempranas o tardías de la enfermedad. Además, el uso de este modelo se puede investigar el papel de las proteínas del estroma frente derivadas de células de cáncer en progresión de la enfermedad mediante el uso de ratones o células modificadas genéticamente. Aunque las inyecciones subcutáneas son más fáciles de realizar, modelos ortotópicos dan lugar a una población de células de cáncer más tumorigénico y más metastásico. Por lo tanto, los resultados obtenidos por medio de la inyección subcutáneas podría ser falsos negativos o falsos positivos ^6,17 fomentar el uso de modelos ortotópico para estudiar el crecimiento del tumor.

Protocol

Los experimentos con animales fueron aprobados por el comité de bienestar de los animales, del Centro Médico de la Universidad de Leiden (LUMC). 1. Preparación de células, Instrumentos y Ratones Un día antes de la operación, se afeitan el / gamma SCID (NSG) ratones NOD a partir del cuarto pezón a la línea media y pesan los ratones para comprobar que todos los ratones tienen pesos más o menos comparables. Autoclave una tijera, dos pinzas y dos pinzas de mosquitos…

Representative Results

La aplicación exitosa del "modelo ortotópico de cáncer de mama" se basa en la inyección adecuada de las células en la almohadilla de grasa mamaria. Errores experimentales tales como la inoculación de las células imprecisa o fugas pueden conducir a variaciones en el tamaño del tumor o incluso la ausencia de un tumor que conduce a la formación de una estructura similar a la que mira una almohadilla de grasa mamaria inyectado con un tampón de control (Figura 2A). La tasa de crecimiento …

Discussion

Inyección ortotópico de células de cáncer de mama es un poderoso modelo para estudiar todos los aspectos del crecimiento del cáncer. La implantación de estas células en la almohadilla de grasa mamaria de los ratones se debe realizar cuidadosamente para evitar la variación en el crecimiento del tumor. Lo más importante, la inyección de la misma cantidad de células a cada ratón es crucial. Para ello, se debe trypsinize las células rigurosamente sin afectar la viabilidad de las células. Las células no viable…

Materials

Name of material/equipment	Company	Catalog number	Comments/Description
Bouin's solution	Sigma-Aldrich	HT10132	Used for investigating the metastasis on lungs
Formalin solution	Sigma-Aldrich	HT501128	Used to fix the tissues
Matrigel, growth factor reduced	Corning	356230	Cells can be resuspended in matrigel for injection
Mosquito forceps	Fine Science Tools	13008-12	Used for stiching
Angled forceps	Electron microscopy sciences	72991-4c	These make the exposure of mammary fat pad easier
Scissors	B Braun Medicals	BC056R	Used to cut open the mice
Straight forceps	B Braun Medicals	BD025R	This is used to open up the skin to expose mammary fat pad
NOD scid gamma mice	Charles River	005557	Experimental animal used for experiment
MDA-MB-231	Sigma-Aldrich	92020424	Experimental cells used for injections
Oculentum simplex	Teva Pharmachemie		Opthalmic ointment used to prevent drying out of eyes
Betadine	Fischer Scientific	19-898-859	Ionophore, used to disinfect the surgical area
Xylazin/Ketamine	Sigma-Aldrich	X1251, K2753	Use injected anesthesia as 10mg/kg and 100mg/kg body weight respectively
Temgesic	Schering-Plough		Use the painkiller as 0,05-0,1mg/kg body weight
DMEM	Life sciences	11995	For trypsin neutralization,use media with serum(FBS:media 1:10 volume); for injection, use media with no serum
Buffered sodium citrate	Aniara	A12-8480-10	Use the volume ratio as citrate:blood; 1:9