Methyltransferases과 공동 인자 유사체와 핵산과 단백질의 순서 특정 레이블
Summary
DNA 및 단백질 서열 특히 친 화성 또는 DNA 또는 단백질 methyltransferases 및 합성 보조 인자 (cofactor) 유사체를 사용하여 형광 기자 그룹으로 표시됩니다. 효소, 아지리 딘 또는 이중 활성 보조 인자 유사체의 특이성 팩터에 따라서는 1 또는 2 단계의 표시에 이용된다.
Abstract
S -Adenosyl -1- 메티오닌 (SAM 또는 AdoMet) 의존성 methyltransferases (MTase)는 DNA, RNA, 단백질, 및 작은 생체의 특정 위치들에서 활성화 AdoMet 메틸기의 전달을 촉매. 이것은 천연 메틸화 반응은 보조 인자 합성 유사체를 사용하여 알킬화 반응의 다양한 확장 될 수있다. 아지리 링 AdoMet의 반응 설 포늄 센터의 교체는 다양한 DNA의 MTases에 의해 DNA와 결합 될 수있다 보조 인자로 연결됩니다. 이 아지리 공동 인자는 아데닌 부분의 다른 위치에서 기자 그룹 장착 내가 DNA (미소 DNA)의 L의 아벨 보내고을 nduced ethyltransferase- S의 equence 별 M 사용할 수 있습니다. 전형적인 예로서 우리는 DNA MTase M.BseCI 및 아지리 딘 보조 인자 (cofactor) 6BAz에서와 5'-ATCG T-3 '순서에서 나 pBR322 플라스미드 DNA의 바이오 틸위한 프로토콜을 제공한 단계. ctivated G의 roups (MTAG)의 m의 ethyltransferase 지시 T의를 ransfer에 사용되는 AdoMet 유사체의 또 다른 클래스의 불포화 알킬 그룹 결과와 활성화 된 메틸 그룹의 확장. 확장 측쇄가 설 포늄 센터와 불포화 결합에 의해 활성화되기 때문에, 이러한 보조 인자들은 이중 – 활성화 AdoMet 유사체 불린다. 이러한 유사 아지리 딘 보조 인자 같은 DNA MTases에 대한 보조 인자로서 기능뿐만 아니라, RNA, 단백질과 작은 분자 MTases에 대한뿐만 아닙니다. 그들은 일반적으로 초 화학 공정에서 리포터기로 표지 유니크 작용기 MTase 기판의 효소 적 변형을 위해 사용된다. 이것은 히스톤 H3 단백질의 형광 표지 용 프로토콜에 예시된다. 작은 프로 파질 그룹의 클릭 표시 다음에 히스톤 H3 라이신 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 단백질에 보조 인자 (cofactor) 아날로그 SeAdoYn에서 전송TAMRA 아 지드와 alkynylated 히스톤 H3. 보조 인자 (cofactor) 유사체와 MTase 매개 라벨은 식별 및 기능 연구 MTase 기판뿐만 아니라 DNA 유전자형과 메틸화 검출을 포함하여 많은 흥미로운 응용 프로그램을위한 실현 가능한 기술을 제공한다.
Introduction
핵산 1, 2, 3, 4 단백질의 특정 라벨링 기능 특성화, 의료 진단 및 (나노) 생명 공학에 대한 주요 관심의 대상이다. 여기에서 우리는 S의 -adenosyl -1- 메티오닌 (AdoMet 또는 SAM) 의존성 methyltransferases (MTases)를 기반으로 이러한 바이오 폴리머에 대한 효소 라벨링 방법을 제시한다. 효소의이 클래스 (EC 2.1.1.) 핵산 및 단백질의 특정 잔기 내의 개별 핵성 위치 (질소, 산소, 황 및 탄소 원자)를 대상으로 자연스럽게 팩터 AdoMet (도 1a) (5)의 활성화 메틸기를 전송한다. 또한, MTases 선호도 태그, 형광 또는 다른 라벨 (그림 1B) 6 특정 라벨링 합성 보조 인자 (cofactor) 유사체를 이용할 수있다. AdoMet 유사체의 두 클래스는 개발되어 있습니다 : S의 equence 별 M의 ethyltransferase-의 I에 대한 아지리 딘 보조 인자를 </strong> nduced L의 아벨 보내고 (미소) 7 ctivated G의 roups의 m의 ethyltransferase 지시 T의를 ransfer 더블 활성화 AdoMet 유사체 (MTAG) 8.
그림 1 :.. methyltransferases (MTases) DNA, RNA, 단백질과 작은 생체 분자 등 다양한 기판에 자연 보조 인자 (cofactor) AdoMet (SAM)에서 A. 메틸 그룹 전송 핵산과 단백질의 B. 레이블 / 기능화 (NNNNN = 의해 촉매 반응 단백질 RNA와 아미노산에 대한 기본 DNA에 대한 쌍, 뉴클레오티드, 합성 보조 인자 (cofactor) 유사체와 녹색에서 대상 잔류 물)와 MTase의 XXXXX = 인식 서열. 리포터기를 함유 아지리 보조 인자 (파란색 영역)특히 대상 잔류 물 (왼쪽)와 더블 활성화 AdoMet 유사체와 결합 순서가 아데닌 링의 첨부하면 두 번째 단계에서 bioorthogonal 클릭 반응에 의해 표시 될 수있는 화학 기자 Y (오른쪽)를 운반하는 확장 알킬 체인 전송에지도한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
아지리 딘 보조 인자는 DNA MTases 가장 잘 작동합니다. 그들은 질소 원자 (9) (또는 N은 10, 11를 – 겨자) 대신 술 포늄 센터 반응성 그룹과 세 개의 원 고리가 포함되어 있습니다. 이 질소 원자의 양성자는 DNA와 전체 공동 인자의 결합을 공유 결합에 이르게 대상 염기에 의한 친 핵성 공격에 대한 아지리 딘 링을 활성화합니다. 아데닌 고리에 리포터 그룹을 부착함으로써 아지리 딘는 보조 인자 (하나의 단계로 DNA를 DNA MTases 라벨과 조합하여 사용될 수있다 <stron g> 왼쪽 그림 1B) 7,12. 15 (아데닌 링의 6 위치에 부착 비오틴과 아지리 공동 인자) 및 바실러스 스테아로써 모필 러스에서 아데닌 특정 DNA MTase (M.BseCI) (16) (그림 2 -이 6BAz 13 DNA의 바이오 틸 상세하게 설명된다 ) DNA의 한 단계 라벨 아지리 보조 인자를 통해 : 프로토콜 부 (2)를 참조하십시오. 헤모필루스 heamolyticus로부터 M.BseCI (ATCG 5'-T-3 '인식 서열), 테르 무스 aquaticus (M.TaqI, 5'-TCG -3에서 DNA MTases')에 추가하여 (M.HhaI 5 'C -G GC-3') 및 Spiroplasma (M.SssI에서, G-C 5'-3 ')가 성공적 6BAz 17 DNA를 비 오티하는데 사용되어왔다. 또, 아지리 딘 조인자 한 단계 형광 DNA 라벨링 18,19 위해 사용될 수있다.
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그림 2. M.BseCI 및 6BAz와 DNA의 서열 특이 한 단계 바이오 틸은 DNA MTase M.BseCI는 이중 가닥 DNA 서열 5'-ATCG T-3 '을 인식하여 자연 번째의 아데닌 아미노기의 메틸 잔류 물 (녹색) AdoMet를 사용하여. 아지리 딘 보조 인자 (cofactor) 6BAz으로 반응 과정이 변경되고 M.BseCI 대상 아데닌과 비오틴 (파란색)를 포함하여 전체 보조 인자 (cofactor)를 결합하여 특정 DNA의 바이오 틸을 시퀀스 리드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
더블 활성화 AdoMet 유사체 불포화 측쇄 대신 술포 센터 메틸기 (도 1b 연장 포함 </strong>, 오른쪽) 20. 술 포늄 센터 β-위치에 불포화 이중 또는 삼중 결합은 전자 공역 안정화에 의한 전이 상태 내에서 불리한 입체 효과를 보상한다. 술포 센터와 불포화 결합 모두 효소 전송 측쇄를 활성화하기 때문에, 이러한 보조 인자들은 이중 – 활성화 AdoMet 유사체 뽑혔다. 통상적으로, 이들은 제 2 단계에서 화학 – 8,21 선택적 레이블링, 아미노, 알킨 아 지드 기 등의 고유의 화학 그룹 (화학 기자)로 측쇄를 전송하는 데 사용된다. RNA와 단백질의 추가 표시를 허용 (28) – 일반적으로 두 번 활성화 AdoMet 유사체는 RNA MTases 22, 23 DNA MTases 8,20,21에 대한뿐만 아니라위한 보조 인자와 단백질 MTases 24뿐만 아니라 작동 할 수 있습니다. 그러나, 확장 된 측쇄는 더 입체적 메틸기보다 까다 롭고 엔지니어링 자주 단백질이다 MTase 의해 활성 부위를 확대 아르EN 효율적인 전송 속도를 얻기 위해 필요한. 구리에 의한 화학적 변형을 다음 용 효소 전송 중에 전이 상태 1. 안정화 2. 반응성 핸들이 문제에 대한 또 다른 해결책은 작은 프로 파길 말단 알킨이 두 가지 기능을 제공 기 (세 탄소)와 AdoMet 유사체를 사용하는 촉매 아 지드 – 알킨 고리 (CuAAC) 화학을 클릭합니다. 이 결과 프로 파르 길 AdoMet 아날로그 (29)는 중성 또는 약간 염기성 조건 하에서 만 사용이 제한 상당히 불안정 밝혀졌다. 이러한 결점은 셀레늄 황 원자를 대체하여 고정 될 수있다. 얻어진 보조인 5 '- [(SE) [(3- S) -3- 아미노 -3- 카르복시] 프로 프 -2- ynylselenonio] -5'- 데 옥시 아데노신 (SeAdoYn,도 3) 야생형 DNA에 의해 허용되고, RNA 단백질 MTases 30 – 많은 경우에 단백질 공학에 대한 필요성을 폐지 32. 이것은 형광의 예로는 프로 히스톤 H3 리신과 TEIN 라벨링 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 33 (: 더블 활성 보조 인자를 통해 2 단계의 단백질 표지도 3은 프로토콜 부 (3) 참조).
도 3 :. Set7 / 9 히스톤 H3의 서열 – 특이 적 두 단계 형광 라벨링, SeAdoYn 및 TAMRA 아 지드 단백질 MTase Set7 / 9 자연스럽게 AdoMet를 사용하여 히스톤 H3에 리신 (4)의 아미노기 (H3K4, 녹색)의 메틸. 이중 활성화 보조 인자 (cofactor)로 SeAdoYn MTase은 라이신 잔기에 작은 프로 파길 그룹 (빨간색)를 전송합니다. 첨부 된 단말기 삼중 결합은 선택적으로 아 지드 – 유도 TAMRA (테트라 메틸, 파랑) 형광과 bioorthogonal 클릭 반응 (구리 촉매 아 지드 – 알킨 고리, CuAAC)에서 수정됩니다.로드 / 52014 / 52014fig3highres.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA의 MTases 아지리 딘 및 보조 인자 (미소 DNA)와 DNA의 1 단계 라벨링 강력한 방법이지만 실험을 계획 할 때 일부의 측면이 고려되어야한다.
아지리 딘 보조 인자 (cofactor) : M.BseCI와 DNA 라벨의 6BAz 농도가 60 μM이었다. 다른 DNA MTases 사용시 보조 인자 농도가 낮은 20 μM이 DNA MTase M.TaqI 19 채용 한 예 농도를 최적화한다. 낮은 농도 6BAz 스트렙 (분석에서 비오틴의 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Kerstin Glensk for preparing the MTases M.BseCI and Set7/9 and gratefully acknowledge funding by the Excellence Initiative of the German Federal and State Governments and RWTH Aachen University. The authors are happy to provide 6BAz and SeAdoYn or other cofactor analogues for collaborative research.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 6BAz | Synthesized according to Weinhold et al., Patent number US 8,129,106, published March 6, 2012. | ||
| β-Mercaptoethanol | Serva | 28625 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | 10304980 | |
| Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Serva | 10688 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Serva | 13375 | |
| Bis-Tris | Gerbu | 1304 | |
| Boric acid | Gerbu | 1115 | |
| Bromophenol blue Na salt | Serva | 15375 | |
| Copper(II) sulfate | Aldrich | C1297 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | 10020090 | |
| Coomassie Brilliant Blue | Serva | 17525 | |
| EDTA disodium salt | Gerbu | 1034 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| GelRed (10000x in water) | Biotium | 41003 | |
| Glycerol (99.5%) | Gerbu | 2006 | |
| FastRuler Low Range DNA Ladder | Thermo Scientific | SM1103 | |
| Histone H3 | Expressionplasmid obtained from Dr. Philipp Voigt and Prof. Danny Reinberg; expression and isolation according to T. J. Richmond et al., J. Mol. Biol. 1997, 272, 301-311. | ||
| M.BseCI | Expressionplasmid obtained from Dr. Michael Kokkinidis; expression and isolation according to Kapetaniou et al., Acta Cryst. 2006, F63, 12-14. | ||
| Methanol | Fisher Scientific | 10675112 | |
| Magnesiumchloride hexahydrate | J.T. Baker | 4003 | |
| MOPS | Gerbu | 1081 | |
| Sodium chloride | Gerbu | 1112 | |
| pH strip (Neutralit) | Merck | 1,095,330,001 | |
| pBR322 | Thermo Scientific | SD0041 | |
| R.TaqI (10u/µl) | Thermo Scientific | ER0671 | |
| SeAdoYn | Synthesized according to Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173. | ||
| Set7/9 | Expressionplasmid obtained from Prof. Danny Reinberg, expression and isolation according to D. Reinberg et al., Genes Dev.2002, 16, 479-489. | ||
| Streptavidin | Gerbu | 3058 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma Life Science | A7631 | |
| SDS Granular | Gerbu | 1833 | |
| di-Sodiumhydrogenphosphat | Merck | 106,586 | |
| TAMRA-azide | |||
| TaqI buffer (10x) | Thermo Scientific | B28 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Acros Organics | 42058 | |
| Tris-HCl | Gerbu | 1028 | |
| Tris-X (TRIS-base) | Gerbu | 1018 | |
| Tris(3-hydroxypropyltriazolyl-methyl)amine (THPTA) | Sigma-Aldrich | 762342 |
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