דור של גזע תאים המושרה pluripotent מחולי ניוון שרירים: תכנות מחדש ללא אינטגרציה יעילה של תאים שתן נגזר
Summary
This protocol entails detailed procedures for isolation of urine derived cells from muscular dystrophy patients; their efficient and rapid reprogramming through Sendai virus transduction.
Abstract
cardiomyopathy dystrophic הוא תוצאה הבינה היטב של ניוון שרירים. יצירת תאים מושרה pluripotent גזע (iPSCs) מחולים עם מחלת ניוון שרירים היא מקור רב ערך לסלולרי במבחנה מערכות מודל מחלה ויכולה לשמש למחקרי הקרנת סמים. תאי שמקורם בחולה שתן כבר בשימוש בתכנות מחדש מוצלח בתאי גזע pluripotent מושרה במטרה לבנות מודל cardiomyopathy dystrophic 1. בהתייחסו לחששות הבטיחות של שילוב מערכות וקטור, אנו מציגים פרוטוקול באמצעות וקטור וירוס שאינו שילוב סנדאי לתמרה של יאמאנאקה גורמים לתאי שתן שנאספו מחולים עם מחלת ניוון שרירים. פרוטוקול זה יוצר לתכנות מחדש באופן מלא שיבוטים תוך 2-3 שבועות. תאי pluripotent הם נטול וקטור על ידי מעבר-13. יכול להיות מובחן iPSCs dystrophic אלה לתוך שריר לב ומשמש גם ללמוד מנגנוני מחלה או להקרנת סמים.
Introduction
קרדיומיופתיה היא הסיבה המובילה השניה למוות בחולים עם מחלת ניוון שרירים דושן והבקר (MD). למרות שמוטציות בגן דיסטרופין צמוד X להתרחש ב 1: 3,500 לידות של זכרים, מעט מאוד ידוע על האירועים המולקולריים ותאיים שמוביל לנזק לשרירי לב מתקדם. תאי גזע אנושיים pluripotent מושרה נגזרים מחולי ניוון שרירים צמחו ככלי רומן כדי לחקור את מנגנוני מחלה הבסיסיים ולהשתמש בסמים להקרנת 1,2.
אי הנוחות הצפויה של ביופסיות עור או דגימות דם עלול להניא חולים צעירים ו / או האפוטרופוסים שלהם לתת את ההסכמה להשתתפות במחקר. דגימות שתן הן מקור בלתי פולשנית של תאים סומטיים שamendable לשיטות תכנות מחדש. הראינו לאחרונה כי תאי שתן שנאספו מחולי ניוון שרירים יכולים להיות מתורבתים וביעילות לתכנות מחדש לiPSCs באמצעות התמרה retroviral עם גורמי יאמאנאקה (Oct3 / 4, Sox2, Klf4, ו- c-Myc; OSKM) 1. החסרון של מסירת גן retroviral הוא שילוב של גני תכנות מחדש לכרומוזומים המארח האקראי. כדי להתגבר על מגבלה זו, השתמשנו וירוס סנדאי הלא שילוב לתכנות מחדש של תאי שתן.
פרוטוקול זה מפרט את תכנות מחדש של תאי וירוס סנדאי שתן מבודדים מחולי ניוון שרירים אז מה שיכול להיות מובחן לתוך שריר לב או סוגי תאים אחרים למחקר נוסף. פרוטוקול זה גם יכול להיות מותאם למחלות ספציפיות מטופל אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
דוגמנות מחלות לב וכלי דם באמצעות iPSCs הופכת גישה נפוצה להבין את התרומה הגנטית 4-6. כמה קשיים בלתי צפויים של קבלת דגימות תאים מחולים, ילדים צעירים במיוחד, יכולים להימנע על ידי המציע את האפשרות של גישה לא פולשנית כגון איסוף שתן. באוכלוסיית חולים הצעירה הזה, הוא לעתים …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Development of this protocol was supported by the Advancing a Healthier Wisconsin and the National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, through Grant Number 8UL1TR000055. Its contents are solely the responsibility of the authors and do not necessarily represent the official views of the NIH.
Materials
| List of Materials | |||
| Name of Reagent/Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 Oz. Specimen Cup with Lid | STL Medical Supply | M9AMSAS340 | For Urine Sample Collection |
| 15 mL BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352097 | |
| 50 mL BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352098 | |
| Round Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A1378-001 | |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| Pen-Strep w/o Glutamine | Life Technologies | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Warm in 37 °C water bath before use |
| B-27 Supplement w/Insulin (50x) | Life Technologies | 17504-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| B-27 Supplement w/o Insulin (50x) | Life Technologies | 0050129SA | Warm in 37 °C water bath before use |
| DMEM/F12 (1:1) | Life Technologies | 11330-032 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Versene, 1:5000 | Life Technologies | 15040066 | Warm in 37 °C water bath before use |
| bFGF (10 µg) | Life Technologies | 13256-029 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Cell Counter Cartridges | Life Technologies | C10228 | |
| Knockout Serum (500 mL Bottle) | Life Technologies | 10828-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| Keratinocyte-SFM (1X), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | Warm in 37 °C water bath before use |
| DMEM, High Glucose, Glutamax | Life Technologies | 10566-016 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Life Technologies | 11765-054 | Warm in 37 °C water bath before use |
| EGF Recombinant Human Protein, Liquid Form | Life Technologies | PHG0311L | Warm in 37 °C water bath before use |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Soln | Life Technologies | 12585-014 | Warm in 37 °C water bath before use |
| TeSR-E8 | Stem Cell Technologies | 5940 | Warm in 37 °C water bath before use |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Selleck | S1049 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | hESC Qualified Matrix, LVED Free |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8890 | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) | Thermo-Scientific | K1081 | |
| FBS-Qualified | Sigma Aldrich | F6178 | Warm in 37 °C water bath before use |
| ADENINE BIOREAGENT | Sigma Aldrich | A2786-5G | Warm in 37 °C water bath before use |
| CHOLERA TOXIN FROM VIBRIO CHOLERAE | Sigma Aldrich | C8052-.5MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| HYDROCORTISONE | Sigma Aldrich | H0888-1G | Warm in 37 °C water bath before use |
| HOLO-TRANSFERRIN FROM HUMAN | Sigma Aldrich | T0665-50MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| 3,3',5-TRIIODO-L-THYRONINE SODIUM SALT | Sigma Aldrich | T6397-100MG | Warm in 37 °C water bath before use |
| DAPI | Santa Cruz Biotechnology | SC-3598 | |
| Fluoromount Aquous mounting medium | Sigma Aldrich | F4680 | |
| 16% Paraformaldehyde | Alfa-Aesar | 43368 | |
| List of Antibodies | |||
| Name of Reagent/Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse anti CD44 – labelled with FITC | BD Biosciences | 560977 | |
| Mouse anti CD146 – labelled with PE | BD Biosciences | 561013 | |
| Mouse anti CD73 – labelled with PE | BD Biosciences | 561014 | |
| Mouse anti-α-smooth muscle actin | Sigma Aldrich | A2547 | |
| Mouse anti-Vimentin | Abcam | ab8978-100 | |
| Mouse Anti – TRA-1-81 | Life Technologies | 411100 | |
| Rabbit anti Oct 3/4 | Santa Cruz Biotechnology | SC-9081 | |
| Mouse Anti Dystrophin | Leica Biosystems | NCL-DYSB | |
References
- Guan, X., et al. Dystrophin-deficient cardiomyocytes derived from human urine: New biologic reagents for drug discovery. Stem Cell Research. 12 (2), 467-480 (2014).
- Dick, E., et al. Exon Skipping and Gene Transfer Restore Dystrophin Expression in Human Induced Pluripotent Stem Cells-Cardiomyocytes Harboring DMD Mutations. Stem Cells Dev. 22 (20), 2714-2724 (2013).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
- Sun, N., et al. Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells as a Model for Familial Dilated Cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), 130ra147 (2012).
- Zhang, Y., et al. Urine derived cells are a potential source for urological tissue reconstruction. J Urol. 180 (5), 2226-2233 (2008).
- Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells. Curr Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).
- Malik, N., Rao, M. S. A review of the methods for human iPSC derivation. Methods Mol Biol. 997, 23-33 (2013).
- Nakanishi, M., Otsu, M. Development of Sendai virus vectors and their potential applications in gene therapy and regenerative medicine. Curr. Gene Ther. 12 (5), 410-416 (2012).
- González-Ramírez, R., Morales-Lázaro, S. L., Tapia-Ramírez, V., Mornet, D., Cisneros, B. Nuclear and nuclear envelope localization of dystrophin Dp71 and dystrophin-associated proteins (DAPs) in the C2C12 muscle cells: DAPs nuclear localization is modulated during myogenesis. J Cell Biochem. 105 (3), 735-745 (2008).
- Villarreal-Silva, M., Centeno-Cruz, F., Suárez-Sánchez, R., Garrido, E., Cisneros, B. Knockdown of dystrophin Dp71 impairs PC12 cells cycle: localization in the spindle and cytokinesis structures implies a role for Dp71 in cell division. PloS One. 6 (8), e23504 (2011).
