Isolatie van Verschillende celpopulaties uit het ontwikkelen van kleine hersenen door Microdissection
Summary
-Nestin uiten voorouders zijn een nieuw geïdentificeerde populatie van neurale voorlopercellen in de zich ontwikkelende cerebellum. De microdissectie techniek hier gepresenteerd in combinatie met fluorescentie-geactiveerde celsortering, kan deze celpopulatie worden gezuiverd zonder contaminatie met andere cerebellaire regio's en kunnen worden gekweekt voor verdere studies.
Abstract
Microdissectie is een nieuwe techniek die specifieke gebieden van een weefsel isoleren en te elimineren verontreiniging uit cellulaire bronnen in naburige gebieden. Deze werkwijze werd eerst gebruikt in de studie van Nestin-expressie voorlopers (NEP), een onlangs geïdentificeerde populatie van cellen in de cerebellaire externe kiemlaag (EGL). Met behulp microdissection in combinatie met fluorescerende-geactiveerde cel sortering (FACS), werd een zuivere populatie van NEPs gescheiden ingezameld van conventionele korrel neuron voorlopers in de EGL en van andere vervuilende Nestin expressie cellen in de kleine hersenen. Zonder microdissection, functionele analyses van NEP zou niet mogelijk zijn geweest met de huidige methoden beschikbaar, zoals Percoll gradiëntcentrifugering en lasermicrodissectie. Deze techniek kan ook worden toegepast voor gebruik met verschillende weefsels die ofwel herkenbare gebieden of fluorescent-gelabelde cellen bevatten. Het belangrijkste is een groot voordeel van deze microdissection techniek is dat geïsoleerde cellen leven en kan worden gekweekt voor verdere experimenten, die op dit moment niet mogelijk is met andere methoden beschreven.
Introduction
Het cerebellum bestaat uit meerdere cellagen, die elk verschillende celtypen. Tijdens de ontwikkeling van de EGL bevat prolifererende korrel neuron voorlopers (BNP), terwijl de moleculaire laag en Purkinje lagen bevatten Bergmann glia en Purkinje neuronen, respectievelijk. Diep in het cerebellum ligt de witte stof, die neurale stamcellen (NSC's) en oligodendrocyten 1 bevat.
Sonic hedgehog (Shh) speelt een cruciale rol bij het reguleren van ontwikkeling van het cerebellum en in het bijzonder bevordert de proliferatie van BNP via binding aan zijn receptor Patched (Ptc), een negatieve regulator van Shh signalering 2-4. Afwijkende activering van Shh signalering genereert medulloblastoom (MB), de meest voorkomende kwaadaardige hersentumor bij kinderen 5,6.
Ptc mutant MB transgene muismodellen zijn krachtige instrumenten voor de studie van de MB en tumoren lijkt menselijk MB 7,8 ontwikkelen. Met behulp van dezemuizen, werd ontdekt dat BNP zijn de cel van oorsprong voor egel-achtige MB 7. Bovendien, naast BNP hebben we recent geïdentificeerde een unieke populatie van neuronale voorlopercellen binnen de EGL van de ontwikkeling cerebellum die ook tot MB kan geven. Deze cellen brengen hoge niveaus van het type VI intermediaire filament-eiwit, Nestin en zogenaamde NEPs 9. NEPs zijn gelegen binnen het diepe deel van de EGL en bestaan kortstondig alleen tijdens de neonatale ontwikkeling van het cerebellum. Ze verbinden zich tot de korrel cellijn als BNP, maar zijn verschillend als ze zijn in rust en niet te uiten Math1, een gevestigde marker voor conventionele BNP 10. Bovendien NEPs leiden tot MB efficiënter dan BNP na activering van de Shh signaleringsroute 9, waardoor ze een nieuwe oorsprong MB tumorvorming maakt.
We hebben eerder geïsoleerd NEPs van de cerebellaire EGL op postnatale dag 4 (P4) van de microdissection techniekhier 9 beschreven. Microdissection via directe microscopische visualisatie van het weefsel maakt bepaalde ontleding van de cerebellaire EGL. Dit is nodig omdat Nestin ook door NSC wordt uitgedrukt in de cerebellaire witte stof en Bergmann glia in de moleculaire laag 1,7,11,12 en het cruciaal dat deze cellen niet worden opgenomen, aangezien de analyse zouden verwarren. Cellen geïsoleerd uit gemicrodisseceerde weefsel kan direct worden gebruikt voor moleculaire analyse of kunnen worden gekweekt voor verdere toepassingen.
Om te helpen bij specifiek microdissecting de EGL en NEPs verder te zuiveren, Math1-GFP (groen fluorescerend eiwit) muizen werden gekruist met Nestin-CFP (cyaan fluorescente eiwit) muizen. De transcriptiefactor Math1 is speciaal ontworpen door BNP en GFP expressie uitgedrukt is duidelijk zichtbaar in de EGL 9,13. Nestin-GVB muizen brengen een nucleaire vorm van GVB en kan gemakkelijk worden gevisualiseerd in de moleculaire laag 9,14. Samen, GFP en GVB uitdrukking creëren grenzen voor microdissection van de EGL (zie figuur 1). GVB-positieve NEPs werden vervolgens geïsoleerd door FACS, na enzymatische dissociatie van de ontleed WR.
Momenteel is de meest gebruikte methode om cellen te isoleren uit de EGL is Percoll gradiënt centrifugering van geheel cerebellaire weefsel 15,16. Deze werkwijze is echter niet volledig uit te sluiten Nestin + celpopulaties van de moleculaire laag en witte stof en kan daarom niet worden gebruikt voor de studie van NEP. Laser capture microdissectie, de overdracht van laserenergie gebruikt om cellen van belang te verwijderen, is een andere methode om specifieke cellen te isoleren in een heterogeen weefsel 17,18 maar gevangen cellen kan alleen worden gebruikt voor het terugwinnen van DNA, RNA en eiwitten en niet kunnen worden gekweekt.
Dit protocol biedt een manier om specifiek te isoleren een levende, zuivere populatie van NEPs van de EGL.Deze techniek kan ook worden toegepast op verschillende types weefsel dat ofwel herkenbare anatomische architectuur of fluorescent gelabelde cellen / regio's. Daarom is het grote voordeel van het opnemen van deze nieuwe techniek microdissectie in celisolatie protocollen die cellen kunnen worden geïsoleerd uit specifieke weefselgebieden elimineren verontreinigende naburige weefsels en cellen kan onmiddellijk voor analyse gekweekt of voor andere toepassingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De microdissectie hier beschreven methode is de eerste procedure kunnen een zuivere populatie van levende cellen voor gebruik in moleculaire en functionele analyses isoleren. Zoals aangetoond door Li et al. 9, NEPs deze methode verkregen kan worden gekweekt en verwerkt in verschillende experimenten en vanwege hun hoge zuiverheid, kan ook worden gebruikt voor microarray-analyse.
Het is zeer belangrijk de tijd te nemen om bedreven met dit microdissectie techniek …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag James Oesterling bedanken voor flowcytometrie hulp. Dit onderzoek werd gesteund door een subsidie van het Amerikaanse National Cancer Institute (R01-CA178380, ZY) en een Amerikaanse National Institutes Postdoctoraal opleiding subsidie (5T32CA009035-37, LWY).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| PDL | Millipore | A-003-E | |
| ultra pure low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| DPBS | Gibco | 14190144 |
References
- Lee, A., et al. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22, 103-114 (1999).
- Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126, 3089-3100 (1999).
- Riobo, N. A., Manning, D. R. Pathways of signal transduction employed by vertebrate Hedgehogs. Biochem J. 403, 369-379 (2007).
- Dahmane, N., et al. The Sonic Hedgehog-Gli pathway regulates dorsal brain growth and tumorigenesis. Development. 128, 5201-5212 (2001).
- Marino, S. Medulloblastoma: developmental mechanisms out of control. Trends Mol Med. 11, 17-22 (2005).
- Yang, Z. J., et al. Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells. Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).
- Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. P. Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants. Science. 277, 1109-1113 (1997).
- Li, P., et al. A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity. Nat Neurosci. 16, 1737-1744 (2013).
- Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390, 169-172 (1997).
- Sutter, R., et al. Cerebellar stem cells act as medulloblastoma-initiating cells in a mouse model and a neural stem cell signature characterizes a subset of human medulloblastomas. Oncogene. 29, 1845-1856 (2010).
- Sotelo, C., Alvarado-Mallart, R. M., Frain, M., Vernet, M. Molecular plasticity of adult Bergmann fibers is associated with radial migration of grafted Purkinje cells. J Neurosci. 14, 124-133 (1994).
- Lumpkin, E. A., et al. Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice. Gene Expr Patterns. 3, 389-395 (2003).
- Encinas, J. M., Vaahtokari, A., Enikolopov, G. Fluoxetine targets early progenitor cells in the adult brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8233-8238 (2006).
- Hatten, M. E. Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro. J Cell Biol. 100, 384-396 (1985).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), (2009).
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274, 998-1001 (1996).
- Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nat Protoc. 1, 586-603 (2006).
