Выделение различных клеточных популяций из развивающихся мозжечка микродиссекции
Summary
Нестин-выражения предшественники являются недавно выявленный население нейронных клеток-предшественников в развивающемся мозжечке. Используя технику микродиссекции представленные здесь в сочетании с флуоресцентной активированный сортировки клеток, это популяция клеток может быть очищен и загрязнение от других мозжечка регионах и могут культивироваться для дальнейших исследований.
Abstract
Микродиссекция является новым методом, который может выделить конкретные регионы ткани и ликвидации загрязнения из клеточных источников в прилегающих районах. Этот метод был впервые использован в исследовании Нестин-экспрессирующих клеток-предшественников (ПОШ), недавно идентифицированный популяция клеток в коре внешнего зародышевого слоя (EGL). Использование микродиссекции в сочетании с флуоресцентной активированный сортировки клеток (FACS), чистый население ПОШ были собраны отдельно от обычных предшественников гранула нейронных в EGL и от других загрязняющих Нестин-экспрессирующих клеток в мозжечке. Без микродиссекции, функциональный анализ ПОШ не было бы возможно с текущими методов, доступных, таких как Перколла градиентного центрифугирования и лазерного захвата микродиссекции. Этот способ также может быть применен для использования с различных тканей, которые содержат либо распознаваемые участки или флуоресцентно-меченых клеток. Самое главное, главное преимущество этой microdissectioТехника п является то, что изолированные клетки живут и могут культивироваться для дальнейших экспериментов, который в настоящее время не представляется возможным с другими описанными методами.
Introduction
Мозжечок состоит из нескольких слоев клеток, каждый из которых различных типов клеток. Во время разработки, EGL содержит пролиферирующих гранул нейронов прекурсоры (ВНП) в то время как молекулярный слой и Пуркинье слой содержит Bergmann глии и нейронов Пуркинье, соответственно. Глубоко внутри мозжечка лежит белое вещество, которое содержит нервные стволовые клетки (НСК) и олигодендроциты 1.
Еж Соник (Тсс) играет важную роль в регуляции развития мозжечка и, в частности, она способствует распространению ВНП через связывание с его рецептором исправленными (PTC), негативный регулятор Тсс сигнализации 2-4. Ненормальная активация передачи сигналов Shh генерирует медуллобластома (МБ), наиболее распространенной злокачественной опухоли мозга у детей 5,6.
Ptc мутантные MB трансгенные мышиные модели являются мощными инструментами для изучения МБ и развиваться опухоли, напоминающие человеческую МБ 7,8. Используя этимышей, было обнаружено, что ВНП являются клетки происхождения для ежа типа МБ 7. Кроме того, в дополнение к ВНП, недавно мы определили уникальную популяцию нейрональных клеток-предшественников в пределах EGL развивающегося мозжечка, которые также могут повлечь за собой МБ. Эти клетки экспрессируют высокие уровни типа VI промежуточного нитей белка, нестин и называются ПОИ 9. ПОШ находятся в глубоководной части EGL и существуют временно только во время развития неонатальной мозжечка. Они привержены гранула клеточной линии, как ВНП, но различны, поскольку они находятся в состоянии покоя и не выражают Math1, хорошо налаженные маркер для обычных ВНП 10. Кроме того, ПОШ приводят к МБ более эффективно, чем ВНП после активации сигнального пути Тсс 9, что делает их роман происхождения для МБ туморогенеза.
Мы ранее изолированные ПОШ из мозжечка EGL в послеродовой день 4 (P4) по методике микродиссекцииОписанный здесь 9. Микродиссекция через прямого микроскопического визуализации ткани позволяет конкретной рассечения мозжечка EGL. Это необходимо, поскольку Нестин также выражается НСК в белого вещества мозжечка и Bergmann глии в молекулярном слое 1,7,11,12 и это было важно, что эти клетки не могут быть включены, так как они бы посрамить анализ. Клетки, выделенные из ткани микродиссекции можно использовать немедленно для молекулярного анализа или они могут быть выращены в течение дальнейших применений.
Для помощи в специально microdissecting на EGL и для дальнейшей очистки ПОШ, Math1-GFP (зеленый флуоресцентный белок) мышей скрестили с нестин-CFP (голубой флуоресцентный белок) мышей. Транскрипционный фактор Math1 специфически экспрессируется ВНП и выражения GFP отчетливо видна в EGL 9,13. Мышей Нестин-CFP выразить ядерную форму CFP и могут быть легко визуализированы в молекулярном слое 9,14. Вместе, GFP и выражение CFP создать границы для микродиссекции на EGL (рисунок 1). CFP-положительные ПОШ были затем выделяли FACS, после ферментативной диссоциации расчлененных EGLs.
В настоящее время наиболее хорошо использовать метод выделения клеток из EGL является Перколла центрифугирования в градиенте всей мозжечка ткани 15,16. Этот метод, однако, не может полностью исключить клеточных популяций Нестин + от молекулярного слоя и белого вещества, и поэтому не может быть использован для изучения ПОИ. Лазерный микродиссекции захвата, который использует передачу энергии лазера для удаления клеток, представляющих интерес, является еще одним методом, используемым для изоляции специфические клетки в гетерогенной ткани 17,18, но захваченные клетки могут быть использованы только для восстановления ДНК, РНК и белка и не состоянии культивировать.
Этот протокол предоставляет возможность специально изолировать живую, чистую популяцию ПОШ от EGL.Этот способ также может быть применен к различным типам тканей, которые либо узнаваемый анатомической архитектуры или флуоресцентно меченых клеток / регионах. Таким образом, основное преимущество включающий этот новый метод микродиссекции в протоколы изолятор является то, что клетки могут быть выделены из конкретных областей ткани, чтобы исключить загрязнение соседней ткани и клетки могут быть собраны непосредственно для анализа или культивированного для других приложений.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод микродиссекции описано здесь первая процедура в состоянии изолировать чистую популяцию живых клеток для использования в молекулярной и функционального анализа. Как показали Li др. 9, ПОИ, полученные с помощью этого метода можно культивировать и включены в различ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Джеймса Oesterling для проточной цитометрии помощи. Это исследование было поддержано грантом Национального института рака США (R01-CA178380, ZY) и учебного гранта Национального института аспирантов (5T32CA009035-37, Lwy).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| PDL | Millipore | A-003-E | |
| ultra pure low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| DPBS | Gibco | 14190144 |
References
- Lee, A., et al. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22, 103-114 (1999).
- Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126, 3089-3100 (1999).
- Riobo, N. A., Manning, D. R. Pathways of signal transduction employed by vertebrate Hedgehogs. Biochem J. 403, 369-379 (2007).
- Dahmane, N., et al. The Sonic Hedgehog-Gli pathway regulates dorsal brain growth and tumorigenesis. Development. 128, 5201-5212 (2001).
- Marino, S. Medulloblastoma: developmental mechanisms out of control. Trends Mol Med. 11, 17-22 (2005).
- Yang, Z. J., et al. Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells. Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).
- Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. P. Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants. Science. 277, 1109-1113 (1997).
- Li, P., et al. A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity. Nat Neurosci. 16, 1737-1744 (2013).
- Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390, 169-172 (1997).
- Sutter, R., et al. Cerebellar stem cells act as medulloblastoma-initiating cells in a mouse model and a neural stem cell signature characterizes a subset of human medulloblastomas. Oncogene. 29, 1845-1856 (2010).
- Sotelo, C., Alvarado-Mallart, R. M., Frain, M., Vernet, M. Molecular plasticity of adult Bergmann fibers is associated with radial migration of grafted Purkinje cells. J Neurosci. 14, 124-133 (1994).
- Lumpkin, E. A., et al. Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice. Gene Expr Patterns. 3, 389-395 (2003).
- Encinas, J. M., Vaahtokari, A., Enikolopov, G. Fluoxetine targets early progenitor cells in the adult brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8233-8238 (2006).
- Hatten, M. E. Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro. J Cell Biol. 100, 384-396 (1985).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), (2009).
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274, 998-1001 (1996).
- Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nat Protoc. 1, 586-603 (2006).
