Os ensaios toxicológicos para efeitos de teste de uma droga epigenética no desenvolvimento, fecundidade e sobrevivência das mosquitos de malária

Summary

A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition.

Abstract

Resistência inseticida representa um grande problema para os programas de controle da malária. Os mosquitos se adaptar a uma vasta gama de alterações no ambiente rapidamente, tornando a malária controlar um problema omnipresente em países tropicais. O aparecimento de populações resistentes inseticida garante a exploração de novas vias alvo de drogas e compostos para o controle do vetor mosquito. Drogas epigenéticas estão bem estabelecidos na pesquisa do câncer, no entanto, não se sabe muito sobre os seus efeitos sobre os insetos. Este estudo fornece um protocolo simples para examinar os efeitos toxicológicos de 3 Deazaneplanocin A (DZNep), uma droga experimental epigenética para terapia de câncer, no vetor da malária, o Anopheles gambiae. Foi observado um aumento dependente da concentração na mortalidade e diminuem de tamanho em mosquitos imaturos expostos a DZNep, enquanto que o composto diminuiu a fecundidade de mosquitos adultos em relação a tratamentos de controle. Além disso, houve uma diminuição dependente da droga em S -adenosilhomocisteína (SAH) hidrolase em mosquitos actividade após exposição a DZNep tratamentos em relação ao controlo. Estes protocolos fornecem o pesquisador com um procedimento simples, passo-a-passo para avaliar vários parâmetros toxicológicos para uma droga experimental e, por sua vez, demonstrar uma abordagem multifacetada única para explorar os efeitos toxicológicos de drogas ou compostos de epigenéticos solúveis em água interesse contra mosquitos vetores e outros insetos.

Introduction

A malária é responsável pelo maior número de mortes relacionadas com o inseto no mundo. Estima-se que 219 milhões de casos ocorrem anualmente em todo o mundo, resultando em cerca de 660 mil mortes, principalmente na África ^1. Apesar dos esforços concertados, os programas da malária enfrentam vários desafios. Enquanto insecticidas tratados com inseticidas e componentes-chave forma pulverização residual interna do programa, a resistência a inseticidas em populações locais impedem esses esforços ^2. O rápido aumento da população de mosquitos resistentes inseticida é largamente atribuído à capacidade de os mosquitos da malária para se adaptar rapidamente às mudanças no seu ambiente e explorar diferentes nichos ^3,4,5. Para superar os mecanismos existentes de resistência a inseticidas, a exploração de alvos inseticida compostos novos e de última geração se justifica. Um protocolo simples, passo-a-passo para determinar a eficácia de insecticidas experimentais sobre as diversas fases da vida de malária mosquitoes aumentaria significativamente esses esforços.

Os estudos farmacológicos de efeitos de drogas em linhagens de células e modelos animais têm estabelecido o uso de drogas epigenéticas como uma ferramenta útil para a modulação da genética e fisiologia das células e organismos. A metilação do DNA e a modificação da histona são dois mecanismos que afectam epigenética expressão de genes em organismos multicelulares sem alterar a sequência de ADN subjacente ^6. Modificações pós traducionais como a metilação desempenham um papel crucial na manutenção da integridade celular e expressão gênica, e pode afetar vários processos fundamentais ^7,8,9. Pesquisa em algumas espécies de insetos têm destacado a importância da epigenética nos processos que envolvem oogenesis e haste manutenção de células ^10, bem como a compensação de dosagem ^11. No entanto, tais aspectos em vetores de doenças estão ainda a ser explorado. Usando um composto para modular o sistema em mosquitos pode nos fornecer emvistas para as novas vias alvo inseticida. 3-Uma Deazaneplanocin (DZNep) é um inibidor de histona-metilação conhecidas, que têm um impacto em vários tipos de cancros têm sido estudados ^{12,13,14,15,16.} DZNep é uma droga solúvel em água estável que epigenética indirectamente inibe a histona-lisina N -metiltransferase (EZH2), um componente do complexo repressor Polycomb 2 (PRC2) em células de mamíferos. PRC2 desempenha um papel importante na regulação do crescimento das células estaminais em organismos multicelulares, e histona metilação é um aspecto chave do silenciamento de genes mediado PRC2. Em ratinhos imunocomprometidos, as células pré-tratadas com DZNep têm demonstrado ser menos ¹⁷ tumorigénico. Esta droga está sendo usada para o estudo de outras doenças, como a doença hepática gordurosa não alcoólica, em que está implicado EZH2 ^18. DZNep é uma S -adenosylhomocysteine ​​estabelecido (SAH) inibidor hydrolase ^{19, 20.} A inibição da SAH-hidrolase numaacumulação de HAS e, por sua vez, leva à inibição da actividade da metiltransferase, limitando os grupos de doadores de metilo disponíveis. HAS é um derivado de aminoácido utilizado por muitos organismos, incluindo insectos, nas suas vias metabólicas. Um estudo recente mostrou que DZNep em doses baixas podem afetar diapausa e retardar o desenvolvimento dos insetos ^21.

Aqui, um protocolo robusto para investigar os efeitos de um composto solúvel em água em vários estágios de vida de mosquitos é desenvolvido. As três partes deste protocolo incluem instruções para examinar os efeitos de um composto solúvel em água na imaturos, fêmeas se alimentam de sangue de adultos, e atividade enzimática do adulto masculino e mosquitos fêmeas. Em primeiro lugar, DZNep é dissolvido em água para estudar o desenvolvimento e sobrevivência de mosquitos imaturos. Isto é realizado em duas concentrações de comparar as diferenças decorrentes de aumento de 10 vezes na exposição de drogas. Para explorar o efeito da droga em adultos mosquitos fêmeas, DZNepé adicionado ao sangue de carneiro desfibrilado e alimentados artificialmente o sangue para o sexo feminino. Subsequentemente, a solução do fármaco na fecundidade é examinada. Finalmente, um ensaio de actividade de enzima é realizado utilizando 5,5'-ditiobis- (ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB) como um indicador para determinar o efeito de inibição DZNep em HAS hidrolase em adultos, machos e fêmeas de mosquitos. Embora este protocolo é desenvolvida com um mosquito da malária, Anopheles gambiae, ele pode ser facilmente adaptado para estudar os efeitos de compostos de interesse em quaisquer espécies de mosquitos ou outros insectos. As técnicas descritas neste protocolo não pode ser eficientemente aplicada a uma droga com pouca ou nenhuma solubilidade em água ou em meio aquoso.

Protocol

NOTA: As três partes do protocolo de descrever a exposição aquosa do fármaco DZNep para mosquitos larvais, uma exposição à base de sangue de fêmeas adultas DZNep para estudar o seu efeito de fecundidade, e SAH hidrolase inibição por DZNep medida utilizando uma técnica colorimétrica simples. Uma representação esquemática destes ensaios é mostrado na Figura 1. 1. imaturos Mosquito Desenvolvimento e sobrevivência Ensaios NOTA: Esta se…

Representative Results

A Figura 1 é uma representação esquemática dos ensaios; que descreve os vários passos do processo listadas neste artigo. À medida que o protocolo baseia-se em diferentes fases da vida dos mosquitos, não existe uma sequência particular a ser seguido para as experiências aqui detalhadas. O utilizador pode escolher para conduzir um ou mais ensaios, ao mesmo tempo, dependendo da disponibilidade de amostras. A Figura 2 demonstra o prato criado par…

Discussion

Há vários passos vitais para o sucesso da aplicação deste protocolo. Para o ensaio larval, deve ser tomado cuidado para rotular e replicar cada concentração de ensaio corretamente. Randomizing amostras de ensaio e adicionar a quantidade designada de droga para as respectivas cavidades de teste é uma parte importante desta montagem experimental. Antes de adicionar 2 ^nd larvas de mosquito para a microplaca de 96 poços, cada larva pode ser colocado sobre uma toalha de papel para 2-3 segundos para remover…

Materials

Name of the Reagent/Equipment	Company	Catalgue Number	Comments
96-well microplate	Fisher Scientific	12565561
Cell culture plate	CytoOne	CC7682-7506
Centrifuge	Sorvall Fresco	76003758	A different centrifuge can be used
Colored tape rolls	Fisher	S68134
Dissection microscope	Olympus	SZ
DTNB	Sigma Aldrich	D8130
DZNep.HCl	Sigma Aldrich	SMLO305
Egg dish cups
Filter papers	Fisher	09-795E
Glass feeders	Virginia Tech
Glass tissue homogenizer
Heating element	Fisher Scientific	NC0520091
Incubator	Percival scientific	I36VLC8	A different incubator can be used
Microcentrifuge tube,  2 ml	Axygen	22-283
Microcentrifuge tube, 1.5 ml	Axygen	MCT-150-C
Micropipette	Eppendorf	4910 000.069
Na2HPO4	Fisher Scientific	M-3154
NaH2PO4	Fisher Scientific	M-8643
pH meter	Mettler Toledo 7easy	S20
Plate reader	Spectramax	M2
SAH	Sigma Aldrich	A9384	store at -20C
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787