A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition.
Résistance insecticide pose un problème majeur pour les programmes de lutte contre le paludisme. Les moustiques se adapter à un large éventail de changements dans l'environnement rapidement, faire du paludisme contrôler un problème omniprésent dans les pays tropicaux. L'émergence de populations résistantes aux insecticides justifie l'exploration de nouvelles voies de cibles de médicaments et composés pour le contrôle des moustiques vecteurs. Médicaments épigénétiques sont bien établis dans la recherche sur le cancer, mais pas beaucoup est connu au sujet de leurs effets sur les insectes. Cette étude fournit un protocole simple d'examiner les effets toxicologiques de 3-déazaneplanocine A (DZNep), un médicament épigénétique expérimental pour le traitement du cancer, sur le vecteur du paludisme, Anopheles gambiae. Une augmentation dépendante de la concentration de la mortalité et de diminution de la taille a été observée chez les moustiques immatures exposés à DZNep, alors que le composé réduit la fécondité des moustiques adultes par rapport au témoin traitements. En outre, on observe une diminution de toxicomanes en S -adénosylhomocystéine (SAH) activité hydrolase chez les moustiques après une exposition à DZNep rapport à contrôler traitements. Ces protocoles prévoient le chercheur avec une procédure simple, étape par étape pour évaluer plusieurs paramètres toxicologiques pour un médicament expérimental et, à son tour, de démontrer une approche unique multi-broches pour explorer les effets toxicologiques des médicaments ou composés de épigénétiques solubles dans l'eau intérêts contre les moustiques vecteurs et autres insectes.
Le paludisme est responsable pour le plus grand nombre de décès liés à insectes dans le monde. Quelque 219 millions de cas se produisent chaque année dans le monde, entraînant environ 660 000 décès, principalement en Afrique 1. Malgré les efforts concertés, les programmes de lutte contre le paludisme sont confrontés à plusieurs défis. Bien que les moustiquaires imprégnées d'insecticides à effet rémanent dans les composants et sous forme de pulvérisation de clés du programme, la résistance aux insecticides chez les populations locales entravent ces efforts 2. L'augmentation rapide des populations de moustiques résistants aux insecticides est largement attribuable à la capacité des moustiques vecteurs du paludisme se adapter rapidement aux changements dans leur environnement et d'exploiter différentes niches 3,4,5. Pour surmonter les mécanismes existants de la résistance aux insecticides, l'exploration de nouvelles cibles d'insecticide et des composés de la prochaine génération est justifiée. Un protocole simple, étape par étape pour déterminer l'efficacité des insecticides expérimentaux sur les différentes étapes de la vie de paludisme mosquitoes pourrait considérablement améliorer ces efforts.
Les études pharmacologiques des effets du médicament sur des lignées cellulaires et des modèles animaux ont établi l'utilisation de médicaments épigénétiques comme un outil utile pour moduler la génétique et de la physiologie des cellules et des organismes. méthylation de l'ADN et de modification des histones sont deux mécanismes épigénétiques qui affectent l'expression génique dans des organismes multicellulaires, sans changer la séquence d'ADN sous-jacente 6. Les modifications post traductionnelles telles que la méthylation jouent un rôle crucial dans le maintien de l'intégrité cellulaire et l'expression des gènes, et peuvent affecter plusieurs processus fondamentaux 7,8,9. Recherche dans certaines espèces d'insectes ont souligné l'importance de l'épigénétique dans des procédés impliquant l'ovogenèse et endiguer la maintenance de la cellule 10, ainsi que la compensation de dosage 11. Toutefois, ces aspects dans les vecteurs de maladies sont encore à explorer. L'utilisation d'un composé à moduler ce système chez les moustiques peut nous fournir ensites dans les nouvelles voies de cibles d'insecticide. 3-déazaneplanocine A (DZNep) est un inhibiteur d'histone méthylation connu, qui ont un impact sur les différents types de cancers ont été étudiés 12,13,14,15,16. DZNep est un médicament soluble dans l'eau stable qui inhibe indirectement épigénétique histone lysine N -méthyltransférase (EZH2), un composant du complexe répressif 2 Polycomb (PRC2) dans des cellules de mammifères. PRC2 joue un rôle important dans la régulation de la croissance des cellules souches dans les organismes multicellulaires, et la méthylation des histones est un aspect clé de la médiation PRC2 silençage génique. Chez les souris immunodéprimées, les cellules pré-traitées avec DZNep ont été montré pour être moins tumorigène 17. Ce médicament est de plus utilisée pour étudier d'autres maladies, telles que la non-alcoolisées maladie du foie gras, dans lequel est impliqué EZH2 18. DZNep est un S -adenosylhomocysteine établie (SAH) hydrolase inhibiteur de 19, 20. L'inhibition de la SAH-hydrolase résultats dans unaccumulation de SAH et, à son tour, conduit à l'inhibition de l'activité méthyltransférase en limitant disponibles groupes donneurs de méthyle. SAH est un dérivé d'acide aminé utilisé par de nombreux organismes, y compris les insectes, dans leurs voies métaboliques. Une étude récente a montré que DZNep à faibles doses peut affecter diapause et retarder le développement chez les insectes 21.
Ici, un protocole robuste pour étudier les effets d'un composé soluble dans l'eau sur les différentes étapes de la vie de moustiques est développé. Les trois parties de ce protocole comprennent des instructions pour examiner les effets d'un composé soluble dans l'eau sur les moustiques femelles adultes immatures, de sang-alimentation et de l'activité enzymatique de mâles adultes et les moustiques femelles. Premièrement, DZNep est dissous dans l'eau pour étudier le développement de moustiques immatures et la survie. Ceci est réalisé à deux concentrations de comparer les différences résultant de dix fois plus de l'exposition au médicament. Pour explorer l'effet de la drogue sur les moustiques femelles adultes, DZNepest ajoutée au sang de mouton défibrillation et nourris artificiellement le sang aux femmes. Par la suite, les résultats de la drogue sur la fécondité est examinée. Enfin, un dosage de l'activité enzymatique est réalisée en utilisant l'acide 5,5'-dithiobis (acide 2-nitrobenzoïque) (DTNB), comme indicateur pour déterminer l'effet de la SAH-hydrolase sur DZNep inhibition chez le mâle adulte et les moustiques femelles. Bien que ce protocole est développé avec un moustique vecteur du paludisme, Anopheles gambiae, il peut être facilement adapté à l'étude des effets des composés d'intérêt sur les espèces de moustiques ou d'autres insectes. Les techniques décrites dans le présent protocole ne peuvent être efficacement appliquées à un médicament avec une solubilité limitée ou pas dans l'eau ou des milieux aqueux.
Il ya plusieurs étapes essentielles à la bonne application de ce protocole. Pour le dosage des larves, il faut prendre soin d'étiqueter correctement et de reproduire chaque concentration d'essai. Randomisation échantillons d'essai et en ajoutant le montant désigné de médicament à des puits d'essai respectifs est une partie importante de ce dispositif expérimental mis en place. Avant d'ajouter 2 ème stade larvaire des moustiques à une microplaque de 96 puits, chaque larve peut ê…
The authors have nothing to disclose.
We thank Victor Marquez for providing DZNep.HCl and Scotty Bolling for manufacturing the bloodfeeders. The Mopti and SUA2La strains of An. gambiae were obtained from the Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4). This work was supported by the Fralin Life Science Institute and the grant from National Institutes of Health 1R21AI094289 to Igor V. Sharakhov.
Name of the Reagent/Equipment | Company | Catalgue Number | Comments |
96-well microplate | Fisher Scientific | 12565561 | |
Cell culture plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
Centrifuge | Sorvall Fresco | 76003758 | A different centrifuge can be used |
Colored tape rolls | Fisher | S68134 | |
Dissection microscope | Olympus | SZ | |
DTNB | Sigma Aldrich | D8130 | |
DZNep.HCl | Sigma Aldrich | SMLO305 | |
Egg dish cups | |||
Filter papers | Fisher | 09-795E | |
Glass feeders | Virginia Tech | ||
Glass tissue homogenizer | |||
Heating element | Fisher Scientific | NC0520091 | |
Incubator | Percival scientific | I36VLC8 | A different incubator can be used |
Microcentrifuge tube, 2 ml | Axygen | 22-283 | |
Microcentrifuge tube, 1.5 ml | Axygen | MCT-150-C | |
Micropipette | Eppendorf | 4910 000.069 | |
Na2HPO4 | Fisher Scientific | M-3154 | |
NaH2PO4 | Fisher Scientific | M-8643 | |
pH meter | Mettler Toledo 7easy | S20 | |
Plate reader | Spectramax | M2 | |
SAH | Sigma Aldrich | A9384 | store at -20C |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 |