A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition.
התנגדות חרקים מהווה בעיה גדולה עבור תוכניות שליטת מלריה. יתושים להתאים למגוון רחב של שינויים בסביבה במהירות, מה שהופך את המלריה לשלוט בעיה בכל מקום בארצות טרופיות. הופעתם של אוכלוסיות עמידות חרקים מצדיק את החקירה של מסלולי רומן יעד סמים ותרכובות לשליטת יתוש וקטור. תרופות אפיגנטיים מבוססות היטב בחקר הסרטן, אך לא הרבה ידועה על ההשפעות שלהם על חרקים. מחקר זה מספק פרוטוקול פשוט לבחינת ההשפעות הרעילות של 3-Deazaneplanocin (DZNep), תרופה ניסיונית אפיגנטיים לטיפול בסרטן, על וקטור המלריה, אנופלס gambiae. עליית ריכוז תלוי בתמותה וירידה בגודל נצפתה ביתושים בוגרים שנחשפו לDZNep, ואילו המתחם הפחית את הפוריות של יתושים בוגרים יחסית לשלוט טיפולים. בנוסף, חלה ירידה בסמים תלויים בS -adenosylhomocysteine פעילות (SAH) hydrolase ביתושים בעקבות החשיפה לDZNep יחסי לשלוט טיפולים. פרוטוקולים אלה מספקים חוקר עם הליך פשוט, צעד-אחר-צעד כדי להעריך נקודות קצה טוקסיקולוגית מרובות עבור תרופה ניסיונית ו, בתורו, להפגין גישה רבת-שיניים ייחודיות לחקר ההשפעות הרעילות של תרופות אפיגנטיים מסיסים במים או תרכובות של עניין נגד יתושי וקטור וחרקים אחרים.
מלריה היא אחראית למספר הגבוה ביותר של מקרי מוות הקשורים חרקים בעולם. 219 מיליון מקרים מוערכים מתרחשים מדי שנה ברחבי העולם, וכתוצאה מכך כ 660,000 מקרי מוות, בעיקר באפריקה 1. למרות מאמצי תוכניות מלריה, בפני מספר אתגרים. בעוד bednets חרקים טופלו ורכיבי מפתח צורת ריסוס שייר מקורה של התכנית, התנגדות לחומרי הדברה באוכלוסיות מקומיות לעכב את המאמצים אלה 2. הגידול המהיר באוכלוסיות יתושים עמידות חרקים מיוחסים במידה רבה ליכולתם של יתושי המלריה להסתגל במהירות לשינויים בסביבה שלהם ולנצל נישות שונות 3,4,5. כדי להתגבר על המנגנונים קיימים התנגדות חרקים, החקירה של מטרות הדברה רומן ותרכובות הדור הבא היא מוצדקת. פרוטוקול פשוט, צעד-אחר-צעד לקביעת היעילות של חומרי הדברה ניסיוניות בשלבי החיים השונים של מלריה מ 'osquitoes היה לשפר באופן משמעותי את המאמצים הללו.
מחקרים פרמקולוגיים של שפעות תרופה על שורות תאים ומודלים של בעלי החיים הקימו את השימוש בסמים אפיגנטיים ככלי שימושי לויסות הגנטיקה והפיסיולוגיה של תאים ואורגניזמים. מתילציה DNA ושינוי היסטון שני מנגנונים אפיגנטיים המשפיעים על ביטוי גנים ביצורים רב-תאיים, מבלי לשנות את רצף ה- DNA הבסיסי 6. שינויי ההודעה translational כגון מתילציה לשחק תפקיד מכריע בשמירה על שלמות תאים וביטוי גנים, ועשויים להשפיע על מספר תהליכים בסיסיים 7,8,9. מחקר בכמה מיני חרקים הדגיש את החשיבות של אפיגנטיקה בתהליכים מעורבים אאוגנזה ותאי גזע תחזוקה 10, וכן פיצוי מינון 11. עם זאת, כגון היבטים בוקטורי מחלה טרם נחקרו. שימוש במתחם לווסת מערכת זו ביתושים עשוי לספק לנו במראות למסלולי יעד הדברה הרומן. 3-Deazaneplanocin (DZNep) הוא מעכב מתילציה היסטון ידוע, המשפיעים על סוגים שונים של הסרטן נחקרו 12,13,14,15,16. DZNep הוא תרופה יציבה מסיסים במים אפיגנטיים שבעקיפין מעכבת -methyltransferase N ליזין היסטון (EZH2), מרכיב של Polycomb המורכב המדכא 2 (PRC2) בתאי יונקים. PRC2 משחק תפקיד חשוב בויסות הצמיחה של תאי גזע ביצורים רב-תאיים, ומתילציה היסטון היא היבט מרכזי של השתקת גני PRC2 תיווך. בעכברי מדוכאי חיסון, תאים טרום שטופלו בDZNep הוכחו להיות פחות tumorigenic 17. תרופה זו הופכת משמשת לחקר מחלות אחרות, כגון מחלת כבד השומני שאינו אלכוהוליים, שבו הוא מעורבת EZH2 18. DZNep הוא מעכב -adenosylhomocysteine S הוקם (SAH) hydrolase 19, 20. העיכוב של תוצאות hydrolase SAH בהצטברות של SAH ו, בתורו, מובילה לעיכוב של פעילות methyltransferase ידי הגבלת קבוצות תורמות מתיל זמינות. SAH הוא נגזר של חומצת אמינו מנוצל על ידי אורגניזמים רבים, כוללים חרקים, במסלולים המטבוליים שלהם. מחקר שנערך לאחרונה הראה כי DZNep במינונים נמוכים עלולים להשפיע דיאפאוזה ולעכב את ההתפתחות בחרקים 21.
כאן, פרוטוקול חזק כדי לחקור את ההשפעות של מתחם מסיס במים בשלבי חיים שונים של יתושים מפותח. שלושה החלקים של פרוטוקול זה כוללים הוראות לבחינת ההשפעות של מתחם מסיס במים ביתושים בוגרים, נקבות האכלה-דם למבוגרים, ופעילות אנזים של זכר בוגר ונקבת יתושים. ראשית, DZNep מומס במים ללמוד פיתוח יתושים בוגר והישרדות. המהלך זה מתבצע בשני ריכוזים להשוות כל הבדלים הנובעים מגידול של פי 10 בחשיפה לסמים. כדי לחקור את ההשפעה של תרופה על יתושי נקבה, DZNep הבוגרמתווסף לדם כבשים defibrillated והאכיל את הדם באופן מלאכותי לנקבות. בהמשך לכך, התוצאה של התרופה על פוריות נבחנה. לבסוף, assay פעילות אנזים מתבצע באמצעות 5,5'-dithiobis- (חומצת 2-nitrobenzoic) (DTNB) כאינדיקטור לקבוע את ההשפעה של DZNep על עיכוב hydrolase SAH בזכר בוגר ויתושים ממין נקבה. בעוד פרוטוקול זה הוא פותח עם יתושים מלריה, אנופלס gambiae, זה יכול להתאים בקלות לחקר ההשפעות של תרכובות של ריבית על כל מינים של יתושים או חרקים אחרים. הטכניקות מפורטות בפרוטוקול זה לא יכולה להיות מיושמות ביעילות לתרופה עם מסיסות מוגבלת או לא במים או בתקשורת מימית.
ישנם מספר צעדים חיוניים ליישום המוצלח של פרוטוקול זה. עבור assay הזחל, יש להקפיד לתייג בצורה נכונה ולשכפל את כל ריכוז בדיקה. באופן אקראי, דגימות בדיקה והוספת הסכום המיועד של תרופה לבארות מבחן המתאימות היא חלק חשוב מניסיוני זה להגדיר. לפני הוספת זחלי היתושים instar 2 nd …
The authors have nothing to disclose.
We thank Victor Marquez for providing DZNep.HCl and Scotty Bolling for manufacturing the bloodfeeders. The Mopti and SUA2La strains of An. gambiae were obtained from the Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4). This work was supported by the Fralin Life Science Institute and the grant from National Institutes of Health 1R21AI094289 to Igor V. Sharakhov.
Name of the Reagent/Equipment | Company | Catalgue Number | Comments |
96-well microplate | Fisher Scientific | 12565561 | |
Cell culture plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
Centrifuge | Sorvall Fresco | 76003758 | A different centrifuge can be used |
Colored tape rolls | Fisher | S68134 | |
Dissection microscope | Olympus | SZ | |
DTNB | Sigma Aldrich | D8130 | |
DZNep.HCl | Sigma Aldrich | SMLO305 | |
Egg dish cups | |||
Filter papers | Fisher | 09-795E | |
Glass feeders | Virginia Tech | ||
Glass tissue homogenizer | |||
Heating element | Fisher Scientific | NC0520091 | |
Incubator | Percival scientific | I36VLC8 | A different incubator can be used |
Microcentrifuge tube, 2 ml | Axygen | 22-283 | |
Microcentrifuge tube, 1.5 ml | Axygen | MCT-150-C | |
Micropipette | Eppendorf | 4910 000.069 | |
Na2HPO4 | Fisher Scientific | M-3154 | |
NaH2PO4 | Fisher Scientific | M-8643 | |
pH meter | Mettler Toledo 7easy | S20 | |
Plate reader | Spectramax | M2 | |
SAH | Sigma Aldrich | A9384 | store at -20C |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 |