La cuantificación de fenotipos en Orofacial<em> Xenopus</em
Summary
Un método para cuantificar el tamaño orofacial y la forma de los embriones de Xenopus laevis ha sido desarrollado. En este protocolo, las mediciones de tamaño tradicionales se combinan con morfometría geométrica para permitir análisis más sofisticados de desarrollo y defectos orofacial.
Abstract
Xenopus se ha convertido en una herramienta importante para la disección de los mecanismos que rigen el desarrollo y defectos craneofaciales. Un método para cuantificar el desarrollo orofacial permitirá análisis más riguroso de fenotipos orofaciales en derogación con sustancias que genéticamente o molecularmente pueden manipular la expresión génica o la función de proteínas. El uso de dos imágenes dimensionales de las cabezas de embriones, se miden las dimensiones tradicionales de tamaño-tales como orofacial anchura, altura y zona-. Además, una medida de la redondez de la abertura de la boca embrionario se utiliza para describir la forma de la boca. Morfometría geométrica de estas dos imágenes dimensionales también se realiza para proporcionar una visión más sofisticada de los cambios en la forma de la región orofacial. Puntos de referencia se asignan a puntos específicos en la región orofacial y coordenadas se crean. Un análisis de componentes principio se utiliza para reducir coordenadas señal a los componentes principales que discriminan entonces el tratamientogrupos. Estos resultados se muestran como un gráfico de dispersión en el que los individuos con formas orofaciales similares se agrupan. También es útil para llevar a cabo un análisis de función discriminante, que compara estadísticamente las posiciones de los puntos de referencia entre dos grupos de tratamiento. Este análisis se muestra en una rejilla de transformación donde los cambios en la posición de punto de interés se consideran como vectores. Una rejilla se superpone a estos vectores a fin de que se muestra un patrón de deformación para mostrar dónde posiciones hitos significativos han cambiado. Cambios en la forma en el análisis de la función discriminante se basan en una medida estadística, y por lo tanto pueden ser evaluados por un valor de p. Este análisis es sencillo y accesible, que sólo requiere un estereoscopio y software freeware, y por lo tanto será una investigación y la enseñanza valiosa de recursos.
Introduction
Entre los tipos más frecuentes y devastadores de defectos de nacimiento en humanos son los que afectan a la boca y la cara, como hendiduras orofaciales 1. Los niños con estructuras orofaciales malformados se someten a múltiples cirugías durante toda su vida y luchan con desfiguraciones faciales, el habla, la audición y problemas de alimentación. Por lo tanto, lo que facilita una nueva investigación en el desarrollo de craneo y orofacial es de suma importancia para la prevención y el tratamiento de estos tipos de defectos de nacimiento en seres humanos. Xenopus laevis ha surgido como una nueva herramienta para la disección de los mecanismos que rigen el desarrollo craneofacial (algunos ejemplos incluyen 2,3,4 -11). Por lo tanto, un método cuantitativo para analizar los cambios de tamaño y forma durante el desarrollo de la cabeza y la cara de esta especie podría ser muy poderosa 3.
A continuación, presentamos un método de este tipo; la combinación de mediciones de tamaño tradicional con morfometría geométrica adaptados de un estudio de Xenopus 12 </sup> y una gran cantidad de estudios que analizan la forma facial humana 13-15. El objetivo de este protocolo es permitir a los investigadores para cuantificar el tamaño de la cara y las formas de distinguir entre los diferentes fenotipos orofaciales durante el desarrollo normal y anormal. Este análisis permitirá una mejor diferenciación entre los defectos craneofaciales sutiles tales como las derivadas de los efectos sinérgicos de los genes y / o factores ambientales. Además, este método de cuantificación también podría revelar incluso leve mejora o rescate de un defecto orofacial. Por lo tanto, esto hace que sea una guía útil en el análisis de productos terapéuticos potenciales.
La combinación de medidas faciales y morfometría geométrica que aquí presentamos permite un análisis estadístico más exhaustivo del tamaño y forma de la región orofacial que los protocolos actuales que utilizan en gran medida sólo uno o el otro 15-18. Además, se presenta una forma sencilla de evaluar tanto el medial y planos laterales dela cara sin necesidad de equipos de imagen tridimensional sofisticada utilizada en los estudios actuales 13,19.
Demostramos este protocolo en Xenopus laevis embriones tratados con un inhibidor del receptor del ácido retinoico que induce el desarrollo orofacial anormal y una mediana de 2,3 paladar hendido. La cuantificación de las dimensiones y la forma de la región orofacial en estos embriones han revelado cambios en el tercio medio facial que es análogo a los seres humanos con hendiduras palatinas similares y modelos de ratón 20,21. Sin embargo, este protocolo puede utilizarse para evaluar los efectos de otros compuestos sobre el desarrollo orofacial tales como sustancias naturales, herbicidas, o proteínas tales como factores de crecimiento. Además, el tamaño y forma cambia orofaciales derivados de la perturbación de la expresión génica a través de la pérdida o ganancia de experimentos de función (utilizando morfolinos antisentido o Crispers / Talens) también pueden ser cuantificados usando este protocolo. Por último, hemos desarrollado este método specificaLLY para evaluar la morfología de Xenopus; sin embargo, se puede modificar fácilmente para el análisis de cualquier vertebrado. Otras aplicaciones también podrían incluir el uso de este protocolo para la comparación de especies estrechamente relacionadas para los estudios evolutivos o ecológicos. Aunque el ejemplo que ofrecemos aquí utiliza este protocolo para describir el análisis de la región orofacial, que fácilmente podría ser modificado para el análisis de otras regiones, órganos o estructuras.
Este protocolo cuantificación orofacial se convertirá en un recurso valioso para la comunidad de investigación, así como una excelente herramienta de enseñanza para los estudiantes de pregrado como una demostración en video.
Protocol
Representative Results
Discussion
Xenopus laevis se ha convertido en una herramienta útil para la disección de los mecanismos de desarrollo de desarrollo orofacial subyacente; sin embargo, actualmente no existen protocolos que describen los cambios de tamaño y forma de esta región en las ranas. El método aquí descrito contribuirá significativamente a la esfera del desarrollo orofacial al permitir una cuantificación más rigurosa de fenotipos orofaciales en Xenopus y otros vertebrados.
El primer aspe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Fondos para la instalación de A. Dickinson de VCU apoyaron este trabajo.
Los autores desean agradecer a Dan Nacu por su talento artístico en la creación de la ilustración esquemática.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Dissecting microscope | Zeiss | fitted with AxioCamICC1 camera | |
| Dumont #5 Inox forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Sterile, disposable scalpel | Sklar | 06-2015 | |
| 24-well plate | Fisher Scientific | 087721 | |
| Standard Disposable transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| 150 mm X 15 mm Petri dishes | Falcon | 351058 | |
| Incubators | Ectotherm | set to 15C or 20C | |
| Modeling Clay | Premo, or other non-toxic modeling clay | in black or white | |
| Straight teasing needle | Thermo Scientific | 19010 | |
| Capillary Tubing (for needles) | FHC | 30-30-1 | Borosil 1.0mm OD x 0.5mm ID/Fiber, 100 mm each |
| Needle Puller, Model P-97 | Sutter Instrument Co, | Needle Puller: P-97 Flaming/ Bown micropipette puller Filament: FB300B | For filaments, use Sutter 3.00mm square box filaments, 3.0mm wide. |
| Pipettemen | Gilson | F144802, F123600, F123602 | |
| BMS-453 | Tocris | 3409 | |
| DMSO | American Bioanalytical | AB00435-01000 | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 | |
| Paraformaldehyde powder | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petri dishes | Falcom | 353003, 351058 | 100 mm diameter and 150 mm in diameter |
| 100% Ethanol | VWR | 89125-170 |
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