Kvantificering af Orofacial fænotyper i<em> Xenopus</em
Summary
En fremgangsmåde til at kvantificere orofacial størrelse og form af Xenopus laevis embryoner er blevet udviklet. I denne protokol, er traditionelle størrelse målinger kombineret med geometriske morphometrics at give mulighed for mere avancerede analyser af orofacial udvikling og defekter.
Abstract
Xenopus er blevet et vigtigt redskab til at dissekere de mekanismer, der styrer kraniofacial udvikling og defekter. En metode til at kvantificere orofacial udvikling vil give mulighed for mere grundig analyse af orofaciale fænotyper ved ophævelse med stoffer, genetisk eller molekylært kan manipulere genekspression eller protein funktion. Anvendelse af to dimensionelle billeder af de embryonale hoveder er de traditionelle størrelsesdimensioner-såsom orofacial bredde, højde og område-målt. Desuden er en rundhed mål for embryonale mundingsåbning anvendes til at beskrive formen af munden. Geometriske morphometrics disse to dimensionelle billeder er også udført for at tilvejebringe en mere sofistikeret visning af ændringer i formen af orofacial region. Seværdigheder er angivet for specifikke punkter i orofacial region og koordinater er oprettet. Et princip komponent analyse anvendes til at reducere skelsættende koordinater til princippet komponenter, der derefter diskriminerer behandlinggrupper. Disse resultater vises som et punktdiagram, hvor individer med lignende orofaciale former klynge sammen. Det er også nyttigt at udføre en diskriminant funktion analyse, som statistisk sammenligner positionerne af landmærker mellem to behandlingsgrupper. Denne analyse er vist på en transformation gitter hvor ændringer i skelsættende position betragtes som vektorer. Et gitter er overlejret på disse vektorer, således at en vridning mønster vises at vise, hvor vigtig milepæl holdninger har ændret sig. Shape ændringer i diskriminant funktion analyse er baseret på et statistisk mål, og kan derfor blive evalueret af en p-værdi. Denne analyse er enkel og tilgængelig, som kun kræver en stereoskop og freeware software, og derfor vil være en værdifuld forskning og undervisning ressource.
Introduction
Blandt de mest udbredte og ødelæggende typer af humane fosterskader er dem, der påvirker munden og ansigtet, såsom orofaciale spalter 1. Børn med misdannede orofaciale strukturer undergår mange operationer i hele deres levetid, og kæmper med ansigts vansiring, tale, hørelse og spiseproblemer. Derfor lette ny forskning i cranio- og orofacial udvikling er afgørende for forebyggelse og behandling af disse typer af fosterskader hos mennesker. Xenopus laevis er dukket op som et nyt værktøj til at dissekere de mekanismer, der styrer kraniofaciale udvikling (nogle eksempler kan nævnes 2,3,4 -11). Derfor kunne en kvantitativ metode til at analysere størrelse og form ændres under udviklingen af hoved og ansigt af denne art være meget kraftig 3.
Her præsenterer vi en sådan fremgangsmåde; kombinerer traditionel størrelse målinger med geometriske morphometrics tilpasset fra en Xenopus undersøgelse 12 </sup> og et væld af undersøgelser, der analyserer menneskelig facial formular 13-15. Målet med denne protokol er at gøre det muligt for forskerne at kvantificere facial størrelse og former til at skelne mellem forskellige orofaciale fænotyper under normal og unormal udvikling. Denne analyse vil give mulighed for en bedre differentiering mellem subtile kraniofaciale defekter, såsom dem, der opstår fra synergistiske virkninger af gener og / eller miljømæssige faktorer. Derudover kunne denne kvantificering metode også afsløre selv lille forbedring eller redning af et orofacial defekt. Dette gør det derfor en nyttig vejledning i at analysere potentielle lægemidler.
Kombinationen af ansigts målinger og geometriske morphometrics præsenterer vi her mulighed for en mere omfattende statistisk analyse af både størrelse og form af den orofacial region end de nuværende protokoller, som i vid udstrækning udnytter kun den ene eller den anden 15-18. Endvidere præsenterer vi en enkel måde at vurdere både de mediale og laterale planeransigtet uden at kræve avanceret tredimensional billedbehandling udstyr, der anvendes i igangværende undersøgelser 13,19.
Vi demonstrerer denne protokol på Xenopus laevis embryoer behandlet med en retinsyrereceptor inhibitor, der inducerer abnorm orofacial udvikling og en median ganespalte 2,3. Kvantificering af dimensionerne og formen af den orofacial region i disse embryoner har afsløret ændringer i midface, der er analog til mennesker med lignende palatinalt kløfter og musemodeller 20,21. Dog kan denne protokol anvendes til at vurdere virkningerne af andre forbindelser på orofacial udvikling såsom naturlige stoffer, herbicider eller proteiner såsom vækstfaktorer. Endvidere orofaciale størrelse og form ændringer som følge af forstyrrelse af genekspression via tab eller gevinst af funktion eksperimenter (ved hjælp af antisense morpholinos eller Crispers / Talens) kan også kvantificeres ved hjælp af denne protokol. Endelig har vi udviklet denne metode specifikally at vurdere Xenopus morfologi; er det imidlertid let modificeres til analyse af alle hvirveldyr. Andre applikationer kan også omfatte hjælp af denne protokol til at sammenligne nært beslægtede arter for evolutionære eller økologiske undersøgelser. Mens det eksempel, vi giver her udnytter denne protokol til at beskrive analyse af den orofacial region, kunne det let modificeres til analyse af andre regioner, organer eller strukturer.
Denne orofacial kvantificering protokol vil blive en værdifuld ressource for forskningsverdenen, samt et glimrende pædagogisk redskab for studerende som en video demonstration.
Protocol
Representative Results
Discussion
Xenopus laevis er blevet et nyttigt redskab til at dissekere de udviklingsmæssige mekanismer underliggende orofacial udviklingsbehov; men der er i øjeblikket ingen protokoller, der beskriver størrelse og form ændringer i denne region i frøer. Den her beskrevne fremgangsmåde vil bidrage væsentligt til området for orofacial udvikling ved at tillade mere præcis kvantificering af orofaciale fænotyper i Xenopus og andre hvirveldyr.
Den første, mest kritiske aspekt af …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nystartede penge til A. Dickinson fra VCU støttet dette arbejde.
Forfatterne ønsker at anerkende Dan Nacu for sit kunstneriske talent i at skabe den skematisk illustration.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Dissecting microscope | Zeiss | fitted with AxioCamICC1 camera | |
| Dumont #5 Inox forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Sterile, disposable scalpel | Sklar | 06-2015 | |
| 24-well plate | Fisher Scientific | 087721 | |
| Standard Disposable transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| 150 mm X 15 mm Petri dishes | Falcon | 351058 | |
| Incubators | Ectotherm | set to 15C or 20C | |
| Modeling Clay | Premo, or other non-toxic modeling clay | in black or white | |
| Straight teasing needle | Thermo Scientific | 19010 | |
| Capillary Tubing (for needles) | FHC | 30-30-1 | Borosil 1.0mm OD x 0.5mm ID/Fiber, 100 mm each |
| Needle Puller, Model P-97 | Sutter Instrument Co, | Needle Puller: P-97 Flaming/ Bown micropipette puller Filament: FB300B | For filaments, use Sutter 3.00mm square box filaments, 3.0mm wide. |
| Pipettemen | Gilson | F144802, F123600, F123602 | |
| BMS-453 | Tocris | 3409 | |
| DMSO | American Bioanalytical | AB00435-01000 | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 | |
| Paraformaldehyde powder | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petri dishes | Falcom | 353003, 351058 | 100 mm diameter and 150 mm in diameter |
| 100% Ethanol | VWR | 89125-170 |
References
- Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374, 1773-1785 (2009).
- Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes. Dev Biol. 365, 229-240 (2012).
- Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. Quantitative Analysis of Orofacial Development and Median Clefts in Xenopus Laevis. Anat Rec (Hoboken). , (2014).
- Dickinson, A., Sive, H. Positioning the extreme anterior in Xenopus: cement gland, primary mouth and anterior pituitary. Semin Cell Dev Biol. 18, 525-533 (2007).
- Dickinson, A. J., Sive, H. Development of the primary mouth in Xenopus laevis. Dev Biol. 295, 700-713 (2006).
- Dickinson, A. J., Sive, H. L. The Wnt antagonists Frzb-1 and Crescent locally regulate basement membrane dissolution in the developing primary mouth. Development. 136, 1071-1081 (2009).
- Barnett, C., et al. Syndrome Transcription Factor is critical for neural crest cell function in Xenopus laevis. Mech Dev. 129, 324-338 (2012).
- Gonzales, B., Yang, H., Henning, D., Valdez, B. C. Cloning and functional characterization of the Xenopus orthologue of the Treacher Collins syndrome (TCOF1) gene product. Gene. 359, 73-80 (2005).
- Reisoli, E., De Lucchini, S., Nardi, I., Ori, M. Serotonin 2B receptor signaling is required for craniofacial morphogenesis and jaw joint formation in Xenopus. Development. 137, 2927-2937 (2010).
- Schuff, M., et al. FoxN3 is required for craniofacial and eye development of Xenopus laevis. Dev Dyn. 236, 226-239 (2007).
- Slater, B. J., Liu, K. J., Kwan, M. D., Quarto, N., Longaker, M. T. Cranial osteogenesis and suture morphology in Xenopus laevis: a unique model system for studying craniofacial development. PLoS One. 4, (2009).
- Vandenberg, L. N., Adams, D. S., Levin, M. Normalized shape and location of perturbed craniofacial structures in the Xenopus tadpole reveal an innate ability to achieve correct morphology. Dev Dyn. 241, 863-878 (2012).
- Bugaighis, I., Mattick, C. R., Tiddeman, B., Hobson, R. 3D Facial Morphometry in Children with Oral Clefts. Cleft Palate Craniofac J. , (2013).
- Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. R. Surface anatomy of the face in Down’s syndrome: anthropometric proportion indices in the craniofacial regions. J Craniofac Surg. 12, 519-524 (2001).
- Scheuer, H. A., Holtje, W. J., Hasund, A., Pfeifer, G. Prognosis of facial growth in patients with unilateral complete clefts of the lip, alveolus and palate. J Craniomaxillofac Surg. 29, 198-204 (2001).
- Parsons, K. J., Andreeva, V., James Cooper, W., Yelick, P. C., Craig Albertson, R. Morphogenesis of the zebrafish jaw: development beyond the embryo. Methods Cell Biol. 101, 225-248 (2011).
- Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. R. Surface anatomy of the face in Down’s syndrome: age-related changes of anthropometric proportion indices in the craniofacial regions. J Craniofac Surg. 13, 368-374 (2002).
- Cooper, W. J., et al. Bentho-pelagic divergence of cichlid feeding architecture was prodigious and consistent during multiple adaptive radiations within African rift-lakes. PLoS One. 5, (2010).
- Klingenberg, C. P., et al. Prenatal alcohol exposure alters the patterns of facial asymmetry. Alcohol. 44, 649-657 (2010).
- Zhao, Y., et al. Isolated cleft palate in mice with a targeted mutation of the LIM homeobox gene lhx8. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 15002-15006 (1999).
- Allam, K. A., et al. The spectrum of median craniofacial dysplasia. Plast Reconstr Surg. , 812-821 (2011).
- Sive, H. L., Grainger, R., Harlard, R. . Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , (2000).
- Cross, M. K., Powers, M. Obtaining eggs from Xenopus laevis females. J Vis Exp. , (2008).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). , (1967).
- Nieuwkoop, P. D. a. F. J. . Normal Table of Xenopus laevis (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metamorphosis. , (1994).
- Abdi, H., Williams, L. J. Principal Component Analysis. WIREs Computational Statistics. 2, (2010).
- Hill, T. L. . P. STATISTICS: Methods and Applications. , (2013).
