Kwantificering van Orofacial Phenotypes in<em> Xenopus</em
Summary
Werkwijze voor het orofaciale grootte en vorm van Xenopus laevis embryo kwantificeren ontwikkeld. In dit protocol worden metingen traditionele formaat gecombineerd met geometrische morfometrie te zorgen voor meer geavanceerde analyses van orofaciale ontwikkeling en defecten.
Abstract
Xenopus is uitgegroeid tot een belangrijk instrument voor het ontleden van de mechanismen die craniofaciale ontwikkeling en defecten. Een methode om orofacial ontwikkeling te kwantificeren zal zorgen voor meer grondige analyse van orofaciale fenotypes bij intrekking met stoffen die genetisch of moleculair kunnen manipuleren genexpressie of eiwit functie. Met tweedimensionale afbeeldingen van de embryonale koppen worden traditionele size-afmetingen zoals orofaciale breedte, hoogte en gebied- gemeten. Daarnaast wordt een ronding maat voor de embryonale mondopening gebruikt om de vorm van de mond beschreven. Geometrische morfometrie van deze tweedimensionale beelden wordt ook uitgevoerd om een meer verfijnde weergave van veranderingen in de vorm van de orofaciale regio. Plaatsen zijn toegewezen aan specifieke punten in het orofaciale gebied en coördinaten worden gecreëerd. Een principle component analyse wordt gebruikt om de mijlpaal coördinaten principe componenten die vervolgens discrimineren de behandeling te verminderengroepen. Deze resultaten worden weergegeven als een scatterplot waarin individuen met gelijkaardige orofacial vormen samen te clusteren. Het is ook nuttig om een discriminantfunctieanalyse die statistisch vergelijkt de posities van de herkenningspunten tussen twee behandelingsgroepen voeren. Deze analyse wordt op een transformatie rooster waar positieveranderingen landmark worden beschouwd als vectoren. Een raster wordt over deze vectoren zodat een kromtrekken patroon wordt weergegeven om aan te geven waar de belangrijke posities mijlpaal zijn veranderd. Vormveranderingen in de discriminantfunctieanalyse zijn gebaseerd op een statistische maat, en derhalve kan worden geëvalueerd door een p-waarde. Deze analyse is eenvoudig en toegankelijk is, is er slechts een stereoscoop en freeware software, en zal dus een waardevol onderzoek en onderwijs resource zijn.
Introduction
Een van de meest voorkomende en verwoestende types van menselijke aangeboren afwijkingen zijn degenen die de mond en het gezicht, zoals orofaciale schisis 1. Kinderen met misvormde orofaciale structuren ondergaan meerdere operaties gedurende hun leven en worstelen met het gezicht misvormingen, spraak, gehoor en eetproblemen. Daarom is het faciliteren van nieuw onderzoek in cranio- en orofaciale ontwikkeling is van cruciaal belang voor de preventie en behandeling van deze vormen van aangeboren afwijkingen bij de mens. Xenopus laevis heeft ontpopt als een nieuw instrument voor het ontleden van de mechanismen die craniofaciale ontwikkeling (enkele voorbeelden zijn 2,3,4 -11). Daarom kan een kwantitatieve methode om de grootte en vorm verandert analyseren tijdens de ontwikkeling van het hoofd en gezicht van deze soort zeer krachtig 3.
Hier presenteren we een dergelijke werkwijze; een combinatie van traditionele grootte metingen met geometrische morfometrie aangepast van een Xenopus studie 12 </sup> en een schat aan studies analyseren van menselijk gezicht vorm 13-15. Het doel van dit protocol is om onderzoekers aan het gezicht grootte en vormen te kwantificeren om onderscheid te maken tussen verschillende orofacial fenotypes tijdens normale en abnormale ontwikkeling. Deze analyse maakt het mogelijk voor een betere differentiatie tussen subtiele craniofaciale defecten, zoals die welke voortvloeien uit synergetische effecten van genen en / of omgevingsfactoren. Daarnaast kan dit kwantificeringsmethode ook zelfs lichte verbetering of redden van een orofacial defect onthullen. Dit maakt het een handige gids bij het analyseren van potentiële therapieën dan ook.
De combinatie gezichts metingen en geometrische morfometrie dat wij hier presenteren maakt een bredere statistische analyse van zowel de grootte en vorm van het orofaciale gebied dan de huidige protocollen die grotendeels gebruik slechts één of de ander 15-18. Verder presenteren we een eenvoudige manier om zowel de mediale en laterale gebieden van beoordelenhet gezicht zonder dat geavanceerde driedimensionale beeldvormende apparatuur die wordt gebruikt in de huidige studies 13,19.
We tonen dit protocol op Xenopus laevis embryo's die behandeld worden met een retinolzuurreceptor remmer dat abnormale orofacial ontwikkeling en een mediaan gespleten gehemelte 2,3 induceert. Kwantificering van de afmetingen en vorm van het orofaciale gebied in deze embryo heeft wijzigingen in de midface die analoog aan mensen met gelijke palatinale kloven en muismodellen 20,21 geopenbaard. Echter, dit protocol worden gebruikt om de effecten van andere verbindingen op orofaciale ontwikkeling zoals natuurlijke stoffen, herbiciden of eiwitten zoals groeifactoren beoordelen. Verder, orofaciale grootte en vorm verandert als gevolg van verstoring van de genexpressie via verlies of overexpressie-experimenten (met behulp van antisense morpholinos of Crispers / Talens) kan ook worden gekwantificeerd met behulp van dit protocol. Tenslotte, deze methode specificatie ontwikkelden welly om Xenopus morfologie beoordelen; echter gemakkelijk aangepast voor analyse van alle gewervelde. Andere toepassingen kunnen ook met behulp van dit protocol voor het vergelijken van nauw verwante soorten voor evolutionaire of ecologische studies. Terwijl het voorbeeld dat we hier bieden maakt gebruik van dit protocol om de analyse van het orofaciale gebied te beschrijven, kan het gemakkelijk worden aangepast voor de analyse van andere regio's, organen, of structuren.
Dit orofaciale kwantificering protocol zal een waardevolle bron voor de onderzoeksgemeenschap, evenals een uitstekend leermiddel voor studenten als een video-demonstratie geworden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Xenopus laevis is uitgegroeid tot een nuttig instrument voor het ontleden van de ontwikkelingsbiologie mechanismen onderliggend orofaciale ontwikkeling; Er zijn nog geen protocollen beschrijven grootte en vorm veranderingen van deze regio bij kikkers. De hier beschreven methode zal een belangrijke bijdrage leveren op het gebied van orofaciale ontwikkeling te creëren door meer rigoureuze kwantificering van orofaciale fenotypes in Xenopus en andere gewervelde dieren.
De eers…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Start-up gelden aan A. Dickinson uit VCU dit werk ondersteund.
De auteurs willen Dan Nacu erkennen voor zijn artistieke talent in het maken van de schematische weergave.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Dissecting microscope | Zeiss | fitted with AxioCamICC1 camera | |
| Dumont #5 Inox forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Sterile, disposable scalpel | Sklar | 06-2015 | |
| 24-well plate | Fisher Scientific | 087721 | |
| Standard Disposable transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| 150 mm X 15 mm Petri dishes | Falcon | 351058 | |
| Incubators | Ectotherm | set to 15C or 20C | |
| Modeling Clay | Premo, or other non-toxic modeling clay | in black or white | |
| Straight teasing needle | Thermo Scientific | 19010 | |
| Capillary Tubing (for needles) | FHC | 30-30-1 | Borosil 1.0mm OD x 0.5mm ID/Fiber, 100 mm each |
| Needle Puller, Model P-97 | Sutter Instrument Co, | Needle Puller: P-97 Flaming/ Bown micropipette puller Filament: FB300B | For filaments, use Sutter 3.00mm square box filaments, 3.0mm wide. |
| Pipettemen | Gilson | F144802, F123600, F123602 | |
| BMS-453 | Tocris | 3409 | |
| DMSO | American Bioanalytical | AB00435-01000 | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 | |
| Paraformaldehyde powder | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petri dishes | Falcom | 353003, 351058 | 100 mm diameter and 150 mm in diameter |
| 100% Ethanol | VWR | 89125-170 |
References
- Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374, 1773-1785 (2009).
- Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes. Dev Biol. 365, 229-240 (2012).
- Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. Quantitative Analysis of Orofacial Development and Median Clefts in Xenopus Laevis. Anat Rec (Hoboken). , (2014).
- Dickinson, A., Sive, H. Positioning the extreme anterior in Xenopus: cement gland, primary mouth and anterior pituitary. Semin Cell Dev Biol. 18, 525-533 (2007).
- Dickinson, A. J., Sive, H. Development of the primary mouth in Xenopus laevis. Dev Biol. 295, 700-713 (2006).
- Dickinson, A. J., Sive, H. L. The Wnt antagonists Frzb-1 and Crescent locally regulate basement membrane dissolution in the developing primary mouth. Development. 136, 1071-1081 (2009).
- Barnett, C., et al. Syndrome Transcription Factor is critical for neural crest cell function in Xenopus laevis. Mech Dev. 129, 324-338 (2012).
- Gonzales, B., Yang, H., Henning, D., Valdez, B. C. Cloning and functional characterization of the Xenopus orthologue of the Treacher Collins syndrome (TCOF1) gene product. Gene. 359, 73-80 (2005).
- Reisoli, E., De Lucchini, S., Nardi, I., Ori, M. Serotonin 2B receptor signaling is required for craniofacial morphogenesis and jaw joint formation in Xenopus. Development. 137, 2927-2937 (2010).
- Schuff, M., et al. FoxN3 is required for craniofacial and eye development of Xenopus laevis. Dev Dyn. 236, 226-239 (2007).
- Slater, B. J., Liu, K. J., Kwan, M. D., Quarto, N., Longaker, M. T. Cranial osteogenesis and suture morphology in Xenopus laevis: a unique model system for studying craniofacial development. PLoS One. 4, (2009).
- Vandenberg, L. N., Adams, D. S., Levin, M. Normalized shape and location of perturbed craniofacial structures in the Xenopus tadpole reveal an innate ability to achieve correct morphology. Dev Dyn. 241, 863-878 (2012).
- Bugaighis, I., Mattick, C. R., Tiddeman, B., Hobson, R. 3D Facial Morphometry in Children with Oral Clefts. Cleft Palate Craniofac J. , (2013).
- Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. R. Surface anatomy of the face in Down’s syndrome: anthropometric proportion indices in the craniofacial regions. J Craniofac Surg. 12, 519-524 (2001).
- Scheuer, H. A., Holtje, W. J., Hasund, A., Pfeifer, G. Prognosis of facial growth in patients with unilateral complete clefts of the lip, alveolus and palate. J Craniomaxillofac Surg. 29, 198-204 (2001).
- Parsons, K. J., Andreeva, V., James Cooper, W., Yelick, P. C., Craig Albertson, R. Morphogenesis of the zebrafish jaw: development beyond the embryo. Methods Cell Biol. 101, 225-248 (2011).
- Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. R. Surface anatomy of the face in Down’s syndrome: age-related changes of anthropometric proportion indices in the craniofacial regions. J Craniofac Surg. 13, 368-374 (2002).
- Cooper, W. J., et al. Bentho-pelagic divergence of cichlid feeding architecture was prodigious and consistent during multiple adaptive radiations within African rift-lakes. PLoS One. 5, (2010).
- Klingenberg, C. P., et al. Prenatal alcohol exposure alters the patterns of facial asymmetry. Alcohol. 44, 649-657 (2010).
- Zhao, Y., et al. Isolated cleft palate in mice with a targeted mutation of the LIM homeobox gene lhx8. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 15002-15006 (1999).
- Allam, K. A., et al. The spectrum of median craniofacial dysplasia. Plast Reconstr Surg. , 812-821 (2011).
- Sive, H. L., Grainger, R., Harlard, R. . Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , (2000).
- Cross, M. K., Powers, M. Obtaining eggs from Xenopus laevis females. J Vis Exp. , (2008).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). , (1967).
- Nieuwkoop, P. D. a. F. J. . Normal Table of Xenopus laevis (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metamorphosis. , (1994).
- Abdi, H., Williams, L. J. Principal Component Analysis. WIREs Computational Statistics. 2, (2010).
- Hill, T. L. . P. STATISTICS: Methods and Applications. , (2013).
