Quantifizierung der Orofacial Phänotypen in<em> Xenopus</em
Summary
Ein Verfahren, um die orofacial Größe und Form des Xenopus laevis Embryonen Quantifizierung entwickelt worden. In diesem Protokoll werden traditionelle Größenmessungen mit geometrischen Morphometrie kombiniert, um für komplexere Analysen der orofazialen Entwicklung und Mängel zu ermöglichen.
Abstract
Xenopus ist zu einem wichtigen Werkzeug für sezieren die Mechanismen für kraniofaziale Entwicklung und Defekten. Ein Verfahren zur orofazialen Entwicklung quantifizieren für strengere Analyse der orofazialen Phänotypen auf Aufhebung mit Substanzen, die die Genexpression oder Proteinfunktion genetisch oder molekular manipulieren lassen. Mit zweidimensionalen Bilder der embryonalen Köpfe werden traditionelle Größendimensionen-wie orofazialen Breite, Höhe und Raum- gemessen. Zusätzlich ist ein Maß für die Rundheit embryonalen Mundöffnung verwendet, um die Form des Mundes zu beschreiben. Geometrische Morphometrie dieser zweidimensionalen Bildern wird auch durchgeführt, um eine anspruchsvollere Ansicht von Änderungen in der Form des orofacial Region. Wahrzeichen sind an bestimmten Stellen im orofazialen Region zugeordnet und Koordinaten erstellt. Eine Hauptkomponentenanalyse wird verwendet, um Wahrzeichen Koordinaten Hauptkomponenten, die dann zu unterscheiden, die Behandlung zu verringernGruppen. Diese Ergebnisse werden als Streudiagramm, in dem Personen mit ähnlichen orofazialen Formen zusammenballen angezeigt. Es ist auch nützlich, eine Diskriminanzanalyse, die die Positionen der Landmarken zwischen zwei Behandlungsgruppen statistisch verglichen zuführen. Diese Analyse basiert auf einer Transformationsnetz, wo Änderungen in Markierungsposition werden als Vektoren betrachtet angezeigt. Ein Raster ist auf dieser Vektoren, so dass ein Verziehen Muster angezeigt, um zu zeigen, wo signifikante Landmarkenpositionen geändert haben überlagert. Formänderungen in der Diskriminanzanalyse auf einem statistischen Maß basiert, und kann daher von einem p-Wert berechnet werden. Diese Analyse ist einfach und zugänglich, nur ein Stereoskop und Freeware-Software erfordern, und somit ein wertvoller Forschung und Lehre Ressource sein.
Introduction
Unter den am weitesten verbreiteten und auch schwerwiegendsten Form der menschlichen Geburtsfehler sind diejenigen den Mund und Gesicht, zu beeinflussen, wie Gesichtsspalten ein. Kinder mit missgebildeten orofazialen Strukturen durchlaufen mehrere Operationen über deren gesamte Lebensdauer und Kampf mit Gesichtsanomalien, Sprache, Gehör und Essstörungen. Deshalb werden neue Forschung in cranio und orofazialen Entwicklung erleichtert ist ausschlaggebend für die Vorbeugung und Behandlung dieser Art von Geburtsschäden beim Menschen. Xenopus laevis wurde als neues Werkzeug zum Präparieren der Mechanismen, die kraniofazialen Entwicklung entstanden (einige Beispiele sind 2,3,4 -11). Daher könnte eine quantitative Methode, um Größe und Form Veränderungen während der Entwicklung des Kopfes und Gesicht dieser Art zu analysieren sehr leistungsfähige 3 sein.
Hier stellen wir ein solches Verfahren; Kombination von traditionellen Größenmessungen mit geometrischen Morphometrie von einer Xenopus-Studie 12 angepasst </sup> und eine Fülle von Studien zur Analyse menschlichen Gesichtsform 13-15. Das Ziel dieses Protokolls ist es, den Forschern ermöglichen, Gesichts Größen und Formen zu quantifizieren, um zwischen verschiedenen orofazialen Phänotypen während der normalen und abnormalen Entwicklung unterscheiden. Diese Analyse wird zur besseren Unterscheidung zwischen subtilen kraniofazialen Defekten wie solche aus synergistische Wirkung von Genen und / oder Umweltfaktoren. Darüber hinaus könnte diese Quantifizierungsmethode auch zeigen sogar leichte Verbesserung oder Rettung eines orofazialen Defekt. Dies macht es zu einem nützlichen Leitfaden bei der Analyse potenzielle Therapeutika daher.
Die Kombination aus Gesichts Messungen und geometrische Morphometrie, die wir hier präsentieren, ermöglicht eine umfassende statistische Analyse der Größe und Form des orofazialen Region als aktuellen Protokolle, die weitgehend nutzen nur eine oder die andere von 15 bis 18. Weiterhin stellen wir eine einfache Möglichkeit, sowohl den medialen und lateralen Ebenen beurteilendas Gesicht ohne aufwändige dreidimensionale bildgebende Geräte in aktuellen Studien 13,19 verwendet erfordern.
Wir zeigen, dass dieses Protokoll über Xenopus laevis Embryonen mit einer Retinsäure-Rezeptor-Inhibitor, abnormen orofazialen Entwicklung und eine mediane Gaumenspalte 2,3 induziert behandelt. Quantifizierung der Abmessungen und der Form des orofacial Region in diesen Embryonen wurde Veränderungen im Mittelgesicht, die analog zu den Menschen mit ähnlichen Gaumenspalten und Mausmodellen 20,21 ist offenbart. Jedoch kann dieses Protokoll verwendet werden, um die Wirkungen von anderen Verbindungen auf orofacial Entwicklung, wie natürliche Stoffe, Herbizide, oder Proteinen, wie Wachstumsfaktoren zu beurteilen. Ferner orofazialen Größe und Form Veränderungen aus Störung der Genexpression über Verlust oder Gewinn von Funktionsversuchen (mit Antisense-Morpholinos oder Crispers / Talens) kann auch mit diesem Protokoll quantifiziert werden. Schließlich diese Methode specifica entwickelten wirlly zu Xenopus Morphologie zu bewerten; es ist jedoch einfach für die Analyse von jedem Wirbeltier modifiziert. Andere Anwendungen könnten auch unter Verwendung dieses Protokolls für den Vergleich nahe verwandter Arten für evolutionäre oder ökologische Studien. Während das Beispiel stellen wir hier nutzt dieses Protokoll, um Analyse der orofazialen Region zu beschreiben, könnte es leicht für die Analyse von anderen Regionen, Organe oder Strukturen verändert werden.
Diese orofazialen Quantifizierung Protokoll wird eine wertvolle Ressource für die Forschungsgemeinschaft sowie ein ausgezeichnetes Lehrmittel für Studenten als Video-Demonstration geworden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Xenopus laevis hat sich zu einem nützlichen Werkzeug für Sezieren der Entwicklungsmechanismen zugrunde liegenden orofazialen Entwicklung; Allerdings gibt es noch keine Protokolle Größe und Form Veränderungen dieser Region bei Fröschen beschreibt. Die hier beschriebene Methode wird erheblich auf das Gebiet der orofazialen Entwicklung, indem sie für eine strengere Quantifizierung der orofazialen Phänotypen in Xenopus und anderen Wirbeltieren beitragen.
Die erste, krit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Start-up-Gelder an A. Dickinson von VCU unterstützt diese Arbeit.
Die Autoren möchten sich Dan Nacu für sein künstlerisches Talent bei der Erstellung der schematischen Darstellung zu bestätigen.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Dissecting microscope | Zeiss | fitted with AxioCamICC1 camera | |
| Dumont #5 Inox forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Sterile, disposable scalpel | Sklar | 06-2015 | |
| 24-well plate | Fisher Scientific | 087721 | |
| Standard Disposable transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| 150 mm X 15 mm Petri dishes | Falcon | 351058 | |
| Incubators | Ectotherm | set to 15C or 20C | |
| Modeling Clay | Premo, or other non-toxic modeling clay | in black or white | |
| Straight teasing needle | Thermo Scientific | 19010 | |
| Capillary Tubing (for needles) | FHC | 30-30-1 | Borosil 1.0mm OD x 0.5mm ID/Fiber, 100 mm each |
| Needle Puller, Model P-97 | Sutter Instrument Co, | Needle Puller: P-97 Flaming/ Bown micropipette puller Filament: FB300B | For filaments, use Sutter 3.00mm square box filaments, 3.0mm wide. |
| Pipettemen | Gilson | F144802, F123600, F123602 | |
| BMS-453 | Tocris | 3409 | |
| DMSO | American Bioanalytical | AB00435-01000 | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 | |
| Paraformaldehyde powder | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petri dishes | Falcom | 353003, 351058 | 100 mm diameter and 150 mm in diameter |
| 100% Ethanol | VWR | 89125-170 |
References
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