구강 안면 표현형의 정량화에<em> Xenopus의</em
Summary
아프리카 발톱 개구리 laevis의 배아의 구강 안면 크기 및 형상을 정량화하는 방법이 개발되었다. 이 프로토콜에서, 기존의 크기 측정은 구강 안면 현상 결함의보다 정교한 분석을 허용하기 위해 기하학적 morphometrics과 결합된다.
Abstract
Xenopus의 개발은 두개 안면 결함을 관리하는 메커니즘을 해부위한 중요한 도구가되었다. 구강 안면 현상을 정량화하는 방법은 유전자 또는 분자 유전자 발현 또는 단백질의 기능을 조작 할 수있는 물질과 폐기시 구강 안면 표현형보다 엄격한 분석을 허용 할 것이다. 배아 머리의 두 차원 이미지를 사용하여, 기존 사이즈의 치수를-같은 구강 안면 폭, 높이 등 및 지역 – 측정한다. 또한, 배아 입 개구의 진원도 측정 입의 형상을 설명하는 데 사용된다. 이러한 이차원 영상의 기하학적 morphometrics 또한 구강 안면 영역의 형상의 변화에보다 정교한 뷰를 제공하기 위해 수행된다. 랜드 마크는 구강 안면 영역의 특정 지점에 할당 및 좌표가 생성됩니다. 주성분 분석은 치료를 판별 원리 성분 표식 좌표를 줄이기 위해 사용되는그룹. 이러한 결과는 비슷한 구강 안면 형태와 개인이 함께 클러스터링하는 산포도로 표시됩니다. 또한 통계적 두 치료군 간의 랜드 마크의 위치를 비교 판별 함수 분석을 수행하는 것이 유용하다. 이 분석은 랜드 마크의 위치 변화가 벡터로 볼 수 있습니다 변환 그리드에 표시됩니다. 그리드는 왜곡 패턴이 중요한 랜드 마크 위치가 변경된 위치를 표시하는 표시되도록이 벡터에 놓이게됩니다. 판별 함수 분석 형상 변화는 통계적 측정치에 기초하며, 따라서 p- 값에 의해 평가 될 수있다. 이 분석은 입체경 프리웨어 소프트웨어를 필요로하는, 단순하며, 따라서 귀중한 연구 및 교육 자료가 될 것이다.
Introduction
인간의 출생 결함의 가장 흔하고 치명적인 유형 중 같은 구강 안면 쪼개진 조각 1로 입과 얼굴에 영향을 미치는 것들이다. 잘못된 구강 안면 구조와 아이들은 평생 동안 여러 수술을 받아야 얼굴 disfigurements, 언어, 청각 먹는 문제를 투쟁. 따라서, cranio- 및 구강 안면 개발의 새로운 연구를 촉진하는 것은 인간의 출생 결함의 이러한 유형의 예방 및 치료에 중요합니다. 아프리카 발톱 개구리 laevis의는 두개 안면 개발을 관리하는 메커니즘을 해부를위한 새로운 도구로 떠오르고있다 (몇 가지 예 2,3,4 포함 -11). 따라서,이 종류의 헤드의 개발 및 얼굴 중 크기 및 형상 변화를 정량적으로 분석하는 방법은 세 매우 강력 할 수있다.
여기서, 우리는 이러한 방법을 제시한다; Xenopus의 연구 (12)에서 적응 기하학적 morphometrics 전통적인 크기 측정을 결합 </인간의 얼굴 형태 13-15을 분석하는 연구의 SUP>를 찾을 수있다. 이 프로토콜의 목표는 연구자가 정상 및 비정상 개발하는 동안 다른 구강 안면 표현형을 구별하는 얼굴 크기와 모양을 정량화 할 수 있도록하는 것입니다. 이 분석은 유전자 및 / 또는 환경 적 요인의 시너지 효과에서 발생하는 것과 같은 미묘한 두개 안면 결함 사이의 더 나은 차별화 수 있습니다. 또한, 이러한 정량화 방법은 또한 구강 안면 결함에도 약간 개선 또는 구조를 밝힐 수있다. 이것은 따라서 잠재적 인 치료제 분석에 유용한 가이드한다.
여기 제시 안면 측정 및 기하학적 morphometrics의 조합은 대체로 하나 또는 다른 15-18 활용 크기 및 현재의 프로토콜보다 구강 안면 영역의 형상 모두 포괄적 통계 분석을 허용한다. 또한, 우리는 내측과 외측의 양쪽면을 평가할 수있는 간단한 방법을 제시현재 연구 13, 19에서 사용 된 복잡한 3 차원 화상 장비 없이도 얼굴.
우리는 아프리카 발톱 개구리에이 프로토콜은 비정상적인 구강 안면 개발 및 중간 구개열 2,3를 유도하는 레티노 산 수용체 억제제로 치료 배아를 laevis의 보여줍니다. 이러한 배아의 구강 안면 영역의 크기와 모양의 정량화 비슷한 구개 쪼개진 조각 및 마우스 모델 (20, 21)와 인간과 유사하다 midface의 변화를 공개했다. 그러나이 프로토콜은 예컨대 성장 인자와 같은 천연 물질, 제초제, 또는 단백질과 같은 구강 안면 발달에 다른 화합물의 효과를 평가하는데 이용 될 수있다. 또한, 손실 또는 함수 실험의 이득을 통해 유전자 발현을 교란으로부터 발생하는 구강 안면 크기 및 형태의 변화 (안티센스 morpholinos 또는 Crispers를 사용하여이 / Talens)도이 프로토콜을 이용하여 정량화 할 수있다. 마지막으로, 우리는이 방법의 사양보다 개발에서야 Xenopus의 형태를 평가하기 위해; 그러나, 용이하게 임의의 척추 동물의 분석을 위해 수정된다. 다른 응용 프로그램도 진화 또는 생태 연구에 밀접하게 관련 종을 비교하는이 프로토콜을 사용하여 포함 할 수있다. 우리가 여기에서 제공하는 예는 구강 안면 영역의 분석을 설명하는이 프로토콜을 사용하지만, 쉽게 다른 지역, 기관, 또는 구조의 분석을 위해 수정할 수 있습니다.
이 구강 안면 정량화 프로토콜은 연구 지역 사회를위한 귀중한 자원뿐만 아니라, 비디오 데모와 같은 학부 학생들을위한 훌륭한 교육 도구가 될 것이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
아프리카 발톱 개구리는 laevis의 발달 기전 구강 안면 개발을 해부하는 데 유용한 도구가되었다; 그러나, 개구리에서이 지역의 크기와 모양 변화를 기술 한 프로토콜은 현재 존재하지 않는다. 여기에 설명 된 방법은 제노 푸스 다른 척추 동물에 구강 안면 표현형보다 엄격한 정량 허용함으로써 구강 안면 개발 분야에 크게 기여할 것이다.
제대로이 프로토콜을 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
VCU에서 A. 디킨슨 시동 돈이 작업을 지원했다.
저자는 개략적 인 그림을 만드는 그의 예술적 재능 댄 Nacu을 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Dissecting microscope | Zeiss | fitted with AxioCamICC1 camera | |
| Dumont #5 Inox forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Sterile, disposable scalpel | Sklar | 06-2015 | |
| 24-well plate | Fisher Scientific | 087721 | |
| Standard Disposable transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| 150 mm X 15 mm Petri dishes | Falcon | 351058 | |
| Incubators | Ectotherm | set to 15C or 20C | |
| Modeling Clay | Premo, or other non-toxic modeling clay | in black or white | |
| Straight teasing needle | Thermo Scientific | 19010 | |
| Capillary Tubing (for needles) | FHC | 30-30-1 | Borosil 1.0mm OD x 0.5mm ID/Fiber, 100 mm each |
| Needle Puller, Model P-97 | Sutter Instrument Co, | Needle Puller: P-97 Flaming/ Bown micropipette puller Filament: FB300B | For filaments, use Sutter 3.00mm square box filaments, 3.0mm wide. |
| Pipettemen | Gilson | F144802, F123600, F123602 | |
| BMS-453 | Tocris | 3409 | |
| DMSO | American Bioanalytical | AB00435-01000 | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 | |
| Paraformaldehyde powder | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petri dishes | Falcom | 353003, 351058 | 100 mm diameter and 150 mm in diameter |
| 100% Ethanol | VWR | 89125-170 |
References
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