Fisiologici Registrazioni e RNA sequenziamento delle appendici gustative del Mosquito febbre gialla<em> Aedes aegypti</em

Summary

Utilizzando due metodi per stimare l'espressione genica nei principali appendici gustative di Aedes aegypti, abbiamo individuato il set di geni putativamente sottostanti le risposte neuronali di composti amari e ripugnanti, come determinato da un esame elettrofisiologico.

Abstract

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of these disease vectors. We have recently identified a bitter sensing neuron in the labellum of female Aedes aegypti that responds to DEET and other repellents, as well as bitter quinine, through direct electrophysiological investigation. These gustatory receptor neuron responses prompted our sequencing of total mRNA from both male and female labella and tarsi samples to elucidate the putative chemoreception genes expressed in these contact chemoreception tissues. Samples of tarsi were divided into pro-, meso- and metathoracic subtypes for both sexes. We then validated our dataset by conducting qRT-PCR on the same tissue samples and used statistical methods to compare results between the two methods. Studies addressing molecular function may now target specific genes to determine those involved in repellent perception by mosquitoes. These receptor pathways may be used to screen novel repellents towards disruption of host-seeking behavior to curb the spread of harmful viruses.

Introduction

Composti come DEET, Picaridin, Citronellale e IR3535 hanno dimostrato di respingere in modo efficace le zanzare, comprese le importanti vettori della malattia Aedes aegypti ^1,2. Registriamo potenziali d'azione dei neuroni sensoriali associati a specifici sensilla gustativa per determinare le cellule coinvolte con repellenza zanzare. Accoppiato con sequenziamento valle di geni espressi in questi tessuti, possiamo identificare i geni più probabile che mediano le risposte di queste cellule per lo screening di nuovi composti per le capacità repellenza migliorate.

RNA-Seq è uno strumento potente, diventando rapidamente standard per il rilevamento delle modifiche temporali e spaziali in espressione genica. RNA-Seq analisi di appendici chemosensoriali insetti e gli organi sono stati utilizzati per scoprire recettori molecolari in diverse specie di insetti ^3-5, migliorando notevolmente il convenzionale PCR-ricerche gene per gene ^6. Gli insetti rappresentano la classe degli animali più diversi, presentano molte opportunità di studiare la connessione tra geni e fenotipi unici. Tecnologia RNA-seq può essere impiegato su qualsiasi tessuto vivente insetto. Allo stesso modo, la registrazione elettrofisiologica da cellule sensoriali all'interno uniporous sensilli gustativi può essere raggiunto in molte diverse specie di insetti. L'abbinamento di queste due tecniche permette ai ricercatori di restringere i geni coinvolti set in un fenotipo chemosensory osservato. Diverse specie presenteranno sfide specifiche, ma possono informare il collegamento tra i geni dei recettori chemosensoriali e un adattamento chemosensory. Le dimensioni e la morfologia dei chemosensory sensilli è variabile e rendere necessario l'risoluzione dei problemi durante la registrazione di potenziali di azione per ridurre il rumore e identificare segnali ripetibili. Dissezioni di organi chemiosensoriali possono essere banale o delicati e richiede tempo, a seconda della morfologia e dimensioni dell'insetto. Recupero di RNA di alta qualità può richiedere un po 'di risoluzione dei problemi e, come ad esempio evitare alcuni pigmenti durantecollezione tessuti.

Mentre dimostrare gli effetti dei composti repellenti attraverso studi comportamentali è diretta e informativo, questo approccio è tempo intenso e largo rispetto al meccanismo d'azione. Elettrofisiologia accoppiato con RNA-Seq consente analisi più specifiche su ciò che spinge a comportamenti di evitamento insetti. Una volta che il "toolkit" della discriminazione chimico è stato identificato in una specie di insetti, i tentativi più specifiche per migliorare il repellenti conosciute sono possibili. Recettori e proteine ​​associate a cellule sensoriali responsabili di questi comportamenti possono essere espressi heterologously per lo screening chimico diretta. Inoltre, modellistica molecolare in grado di prevedere quali sostanze chimiche si suscitare reazioni forti da questi recettori ^7.

L'istantanea di tutti i geni attivi in ​​una serie limitata di tessuti chemosensoriali può anche essere utile per identificare geni simili in altre specie. Utilizzando omologia di sequenza e di espressione similarities, i ricercatori possono formare gruppi di recettori molecolari più probabile che mediano le risposte a repellenti che sono ampiamente efficaci sugli insetti. Vi presentiamo il seguente protocollo per aiutare i ricercatori a decostruire percorsi chemosensoriali insetti e di convincere di più per approfondire la neuroetologia di non-modello e insetti economicamente importanti.

Protocol

1. allevamento Ae. adulti aegypti Le uova si schiudono in circa ¾ di pollice in acque poco profonde cassetto. Sovraffollamento ridurrà la dimensione degli adulti. Larve posteriore a 25 ° C (12-HL: 12-HD) ed alimentare con cibo per pesci a terra. NOTA: sovralimentazione può ridurre i tassi di sopravvivenza. Rimuovere pupe individualmente da pipetta Pasteur quotidiano e trasferimento in piatti di plastica (9 centimetri × 5,5 centimetri) all'interno secchiell…

Representative Results

Le registrazioni in tracce di potenziali d'azione da Ae. aegypti sensilla gustativa (Figura 1) dimostrare l'efficacia della stimolazione diretta con una gamma di prodotti chimici. Questa tecnica può essere usata per quantificare risposte a qualsiasi sostanza chimica stimolante contando punte di una data ampiezza e durata in un intervallo di tempo ragionevole (generalmente inferiore a 500 ms). Registrazioni Trace devono essere facilmente riproducibili sotto un dato insieme di condizioni…

Discussion

L'aspetto più impegnativo di potenziali d'azione di registrazione da sensilla gustativa è decidere quali risposte sono "normali". Quando impiegando singolo sensillum gustativa punta registrando la prima volta per una determinata specie di insetti, il numero totale e sensibilità dei neuroni recettori gustativi (GRN) sono probabilmente sconosciuta. Molte registrazioni preliminari vengono prima tenuti a decidere la gamma e le concentrazioni di sostanze chimiche da testare. In questo caso, abbiamo comin…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Glass capillary	A-M Systems	628000	Standard, 1.5mm X 0.86mm, 4"
Silver wire	A-M Systems	7875	.015" bare
Tungsten wire	Alfa Products	369	0.127mm diameter
Fine forceps	Fine Science Tools	11252	#5SF Inox
Refridgerated stage	BioQuip Products	1429	Chill Table
Preamplifier	Syntech	Taste Probe	preamplifier
Software for electrophysiology	Syntech	Autospike	software for electrophysiology
TetraMin fish food	Tetra	Tropical fish food granules	fish food ground to fine powder
TRIzol	Life Technologies	15596-026	RNA isolation reagent
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74136	includes gDNA eliminator and RNeasy spin columns
Nanodrop spectrophotometer	Nano Drop Products	ND-1000	tabletop spectrometer
R statistics	freeware (created by Robert Gentleman and Ross Ihaka)	www.r-project.org	Use the lm function of the stats package and the equiv.boot function of the equivalence package in the R computing environment.
1.5ml tube rack	Evergreen	240-6388-030	Pour liquid nitrogen into a few empty wells to freeze and grind tissue.
1.5mL collection tubes with pestle	Grainger	6HAX6	RNase free
Centrifuge	Thermo Scientific	11178160	Spin down frozen tissue to keep at bottom of 1.5 mL tube.
Primer-BLAST Primer Designing tool	NCBI	n/a