RNA 시퀀싱과 생물 정보학 분석은 마우스 EMLcells의 린-CD34 + 린-CD34- 부분 집단에서 유의 및 발현 된 전사 인자를 식별하는 데 사용되었다. 이들 전사 인자는 자기 갱신 린-CD34 +를 부분적으로 분화 된 린 - CD34- 세포 사이의 스위치를 결정하는데 중요한 역할을 할 수도있다.
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방법 논문
RNA 시퀀싱 분석하여 EML 조혈 전구체 세포의자가 재생 (self-renewal)과 분화를 조절하는 중요한 요소의 식별
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
조혈 줄기 세포 (조혈 모세포)는 백혈병과 림프종 등 많은 질병에 환자의 조혈 시스템을 다시 이식 치료를 위해 임상 적으로 사용된다. 조혈 모세포의자가 재생과 분화를 조절하는 메커니즘을 해명하는 연구 및 임상 사용을 위해 조혈 모세포 응용 프로그램에 대한 중요하다. 그러나 의한 시험 관내에서 증식 그들의 무능력 조혈 모세포의 대량을 얻을 수 없다. 이 장애물을 극복하기 위해, 우리는 본 연구를위한 모델 시스템으로, 마우스 골수 유래 세포주, EML (적혈구, 골수 및 림프) 세포주를 사용 하였다.
RNA 시퀀싱 (RNA-SEQ)는 점점 유전자 발현 연구를위한 마이크로 어레이를 대체하는 데 사용되어왔다. 여기서는 EML 세포 자기 갱신 및 분화의 조절에 중요한 요소 가능성을 조사하기 위해 RNA-SEQ 기술을 사용하는 상세한 방법을보고한다. 이 문서에서 제공하는 프로토콜은 세 부분으로 나누어 져 있습니다. 첫 번째 파T는 어떻게 문화 EML 세포와 별도의 린-CD34 + 린-CD34- 세포에 대해 설명합니다. 프로토콜의 두 번째 부분은 총 RNA 준비 및 높은 처리량 시퀀싱에 대한 후속 도서관 건설을위한 자세한 절차를 제공합니다. 마지막 부분은 RNA-SEQ 데이터 분석을위한 방법을 설명하고 린-CD34 + 및 CD34- 린 - 세포 간의 발현 된 전사 인자를 식별하는 데이터를 사용하는 방법을 설명합니다. 가장 현저하게 발현 된 전사 인자는 EML 세포 자기 갱신 및 분화를 제어하는 전위 키 레귤레이터 인 것으로 확인되었다. 이 글의 토론 섹션에서, 우리는이 실험의 성공적인 성능을위한 주요 단계를 강조 표시합니다.
요약하면, 본 연구는 EML 세포에자가 재생과 분화 잠재력 레귤레이터를 식별하기 위해 RNA-SEQ 기술을 사용하는 방법을 제공한다. 확인 된 주요 요인은 시험관과 내가 다운 스트림 기능 분석을 실시한다n 개의 생체.
서론
조혈 줄기 세포는 성인 골수 틈새에 주로 존재 희귀 혈액 세포이다. 이들은 혈액을 보충하기 위해 필요한 세포 및 면역 시스템 (1)의 제조를위한 책임이있다. 줄기 세포의 일종으로서, 조혈 모세포는자가 재생과 분화를 모두 할 수있다. 조혈 모세포의 운명 결정을 제어하는 메커니즘을 해명,자가 재생 (self-renewal) 또는 분화 중 하나를 향해, 혈액 질환 연구 및 임상 사용 2 조혈 모세포의 조작에 유용한 지침을 제공 할 것입니다. 연구자들이 직면 한 문제는 조혈 모세포가 유지되고 매우 제한적으로 시험 관내에서 확장 될 수 있다는 것이다; 그들의 자손의 대부분은 부분적으로 문화 2에서 차별화된다.
전체 게놈 규모에서 자기 갱신 및 분화 과정을 조절 키 레귤레이터를 식별하기 위해, 우리는 모델 시스템으로서 마우스 원시 조혈 전구 세포 라인 EML을 사용했다. 목세포주는 쥐의 골수 3,4에서 파생된다. 다른 성장 인자가 공급되면, EML 세포는 시험 관내에서 5 적혈구, 골수 및 림프 세포로 분화 할 수있다. 중요한 것은,이 세포주 배양 배지가 multipotentiality 유지 여전히 줄기 세포 인자 (SC....
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프로토콜
1. EML 세포 배양 및 시스템과 정렬 자기 셀 사용 린-CD34 + 린-CD34- 세포의 분리 형광을 활성화 셀 정렬 방법
- 줄기 세포 인자 컬렉션 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포 배양 배지의 제조 :
- 37 ° C 세포 배양 인큐베이터에서 5 % CO 2에서 25cm 2 플라스크 (표 1)에 10 % FBS를 함유하는 DMEM 배지에서 배양 BHK 세포.
- 세포가 80로 성장할 때 - 90 % 합류, PBS 10 ml로 한 번 세포를 씻으십시오. 단층 0.25 % 트립신 EDTA 용액 5 ㎖를 첨가하고, 세포가 분리 될 때까지 실온 (RT)에서 5 분 동안 세포를 배양한다.
- 피펫은 아래로 부드럽게 솔루션 위는 세포의 덩어리를 분쇄한다. 트립신 활동을 중지하기 위해 플라스크에 완전한 DMEM 5 ML을 추가합니다. 실온에서 5 분 동안 200 XG에서 원심 분리하여 세포를 수집합니다.
- 배지를 제거하고 신선한 BHK 세포 배양 배지 10ml에 세포 펠렛을 재현 탁. 전송이 새로운 75cm이 플라스크에 단계 1.1.4에서 세포 현탁액 ㎖의 플라스크에 신선한 BHK 세포 배양 ....
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결과
린 - CD34 + 및 CD34- EML 린 - 세포에서 차별적으로 발현 된 유전자를 분석하기 위해, 우리는 RNA-SEQ 기술을 사용 하였다.도 1은 절차의 흐름을 도시한다. 자기 세포 분류에 의한 혈통 부정적인 세포의 분리 후, 우리는 린-SCA + CD34 + 및 FACS 아리아를 사용하여 린-SCA-CD34- 세포를 분리. 린 풍부한 EML 세포는 항 CD34, 안티 SCA1 리니지 칵테일 항체로 염색 하였다. 만 선형 적 세포 SCA1 및 CD34 발현의 분석을 위해 문이되었다. 두 집단 (SCA + CD34 + 및 SCA-CD34- EML 세포) FACS 분석 (그림 2) (6)에 의해 관찰 될 수있다.
세포 분리 후, 우리는 각각 CD34 + 및 CD34- 세포에서 총 RNA를 추출 RNA의 품질을 분석 하였다. RNA-SEQ 데이터의 정확도는 크게 RNA-SEQ 라이브러리의 질에 의.......
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토론
포유 동물의 사체는 34-38 매우 복잡하다. RNA-SEQ 기술은 유전자 발현 분석을위한 다른 방법에 비해 많은 장점을 가지고 사체 분석, 신규 성적 검출 및 단일 뉴클레오타이드 변이 검색 등의 연구에서 점점 더 중요한 역할을한다. 도입부에서 언급 한 바와 같이, 그 마이크로 어레이 혼성화 아티팩트를 극복하고 새로운 사체 드 노보를 식별하는데 사용될 수있다. RNA 시퀀싱의 한 가지 제한은 생어 시퀀싱에 비해 상대적으로 짧은 읽기 길이입니다. 그러나, 시퀀싱 기술의 급속한 개선으로, 길이가 지속적으로 증가하고 읽습니다. 이 논문에서, 우리는 마우스 EML 세포자가 재생 (self-renewal)과 분화에 잠재적 인 키 레귤레이터를 식별하기 위해이 기술을 사용하는 자세한 방법을 제공합니다.
이 프로토콜의 첫 단계는 키 EML 세포 배양이다. EML는 조혈 전구 세포 라인이며 비록 그것이있을 수SCF와 대량으로 전.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
JQW, SZ, SD 및 KC는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)과 스타만 오길비 기금(Staman Ogilvie Fund-Memorial Hermann Foundation)의 보조금으로 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 항생제-항진균제 | Invitrogen | 15240-062 | BHK 세포 배양 |
| 안티 마우스 CD34 FITC | eBioscience | 11-0341-81 | FACS 분류 |
| 안티 마우스 Ly-6A/E(Sca-1) PE | eBioscience | 12-5981-81 | FACS 분류 |
| APC 마우스 계통 항체 칵테일 | BD Biosciences | 558074 | FACS 분류 |
| BD FACSAria 세포 분류기 | BD Biosciences | 특별 제공 sysmtem | FACS |
| 분류 Corning™ 세포 배양 처리 플라스크 75 cm2 | Corning이 세포 | 배양 | trade 430641 |
| 되었습니다. 세포 배양 처리 플라스크 25 cm2 | Corning incorporated | 430639 | 세포 배양 |
| Deoxyribonuclease I, 증폭 등급 | Invitrogen | 18068-015 | 라이브러리 준비 |
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 | BHK 세포 배양 |
| DPBS | Gibco | 14190 | 세포 배양 |
| HI FBS | Invitrogen | 16140071 | BHK 세포 배양 |
| 말 혈청 | Invitrogen | 16050-122 | EML 세포 배양 |
| IMDM | HyClone | SH30228.02 | EML 세포 배양 |
| L-글루타민 | Invitrogen | 25030-081 | 세포 배양 |
| 계통 세포 고갈 키트, 마우스 | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | 계통 음성 세포 분리 |
| NanoVue Plus 분광 광도계 | GE Healthcare | 28-9569-62 | 품질 관리 |
| Thermo Scientific ™ 냅코&트레이드; 8000 Water-Jacketed CO2 인큐베이터 | Thermo Scientific | 15-497-002 | 세포 배양 |
| 페니실린-스트렙토마이신 | 인비트로겐 | 15140-122 | EML 세포 배양 |
| TRIzol® 시약 | Invitrogen | 15596-018 | RNA exraction |
| TruSeq™ RNA Sample Prep Kit v2 -Set B (48 rxn) | Illumina | RS-122-2002 | Library preparation |
| 2100 전기영동 바이오분석기 기기 | Agilent | G2939AA | 품질 관리 |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | 세포 배양 |
| 0.45 µ m 주사기 필터 | Nalgene | 190-2545 | 세포 배양 |
참고문헌
- Chambers, S. M., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell aging: wrinkles in stem cell potential. Stem Cell Rev. 3, 201-211 (2007).
- Wu, J. Q., et al. Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and diffe....
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재인쇄 및 허가
